B59380–AD
99 of 135
Märkus. Igal juhul hoidke valmissegusid temperatuuril 2 kuni 8 °C ja valguse eest kaitstult.
B – protseduur kaasneva fikseerimisega
Reagendi ettevalmistamine
Valmistage ette segu „Fix-and-Lyse”, lisades 25 µl LAHJENDAMATA IOTest 3 10-kordset* fiksaatorlahust (viitenr
A07800) 1ml VersaLyse'ile.
Keerutage katsuteid 3 kuni 5 sekundit.
(*) NB! Segu „Fix-and-Lyse” puhul kasutatakse IOTest 3 fiksaatorlahust (viitenr A07800) neljakümnekordse
kontsentreeritud lahusena, mitte 10-kordse lahusena (nominaalne kontsentratsioon).
Valmistage ette sobiv kogus segu „Fix-and Lyse”, lähtudes lüüsitavate proovide arvust (1 ml segu katsuti kohta).
Iga analüüsitud proovi kohta on lisaks proovikatsutile vaja kontrollkatsutit, milles verelibled segatakse
isotüüp-kontrolliga, mis vastab konkreetsele valitud värvainele.
1. Lisage igasse proovikatsutisse antikehade hulk, mida soovitab tootja, et värvida 5 × 10
5
leukotsüüti.
2. Lisage igasse kontrollkatsutisse isotüüp-kontrolli hulk, mida soovitab tootja, et värvida 5 × 10
5
leukotsüüti.
3. Lisage mõlemasse katsutisse 100 µl proovi (eellahjendatud või mitte). Keerutage katsuteid ettevaatlikult.
4. Inkubeerige, järgides kasutatud antikehade tehnilistes juhistes toodud tingimusi.
5. Lisage 1 ml segu „Fix-and-Lyse” ja keerutage kohe 1 sekundi jooksul.
6. Inkubeerige vähemalt 10 minutit toatemperatuuril (18–25 °C) valguse eest kaitstult.
Kui protseduur ei näe ette pesemist, on katsutid valmis tsütomeetriliseks analüüsiks.
NB! Kui valmissegusid peab pesema, ärge analüüsige neid enne etappide 7 kuni 11 läbimist.
7. Tsentrifuugige toatemperatuuril 5 minutit 150 × g juures.
8. Eemaldage aspireerimisega ülemine vedelikukiht.
9. Suspendeerige uuesti vereliblede graanuleid 3 ml PBS-is.
10. Tsentrifuugige toatemperatuuril 5 minutit 150 × g juures.
11. Eemaldage aspireerimiseks ülemine vedelikukiht ja suspendeerige vereliblede graanuleid uuesti 0,5
ml või 1 ml PBS-is ja 0,1% formaldehüüdis, kui valmissegusid tuleb hoida vähem kui 24 tundi. (0,1%
formaldehüüdi PBS-i saamiseks tuleb lahjendada 12,5 µl IOTest 3 fiksaatorlahust (REF A07800) ja selle 10×
kontsentratsiooni 1 ml PBS-is).
Neid valmissegusid võid hoida kuni 24 tundi temperatuuril 2 kuni 8 °C valguse eest kaitstult.
ANTIKOAGULANT
EDTA (K3EDTA) trikaaliumsool annab parimad tulemused sõltumata kasutatavast meetodist ja sellest, kas pärast
lüüsimist toimub pesemine või mitte.
ACD ja hepariin annavad häid tulemusi kõikide protseduuridega, v.a kaasneva fikseerimiseta protseduuriga, kui
sellele järgneb pesemine. Nende antikoagulantidega soovitame kasutada kaasneva fikseerimisega protseduuri,
millele järgneb pesemine.
ANALÜÜS
Erütrotsüüdi jäägid võivad esile kutsuda kitsasnurga valguse difraktsiooni signaali (otsehajumine (Forward Scatter)
ehk FS), mis on suurem kui teiste kaubanduslike lüüsimisreagentidega saadud tulemused. Selle tulemusena võib
selle parameetri (läveväärtuse) eristaja tavaline säte (või vaikesäte) olla VersaLyse'i jaoks liiga nõrk.
Seetõttu on soovitatav tsütomeetrit reguleerida tavapärase ettevalmistamise valmendamise esimestel hetkedel.
Näiteks lüüsitud täisvere puhul on soovitatav kasvavalt suurendada eristaja väärtust, kuni leukotsüüdid on FS-
versus SS-tüübi histogrammil nähtavad, seejärel ettevaatlikult reguleerida FS-i ja SS-i signaalide võimendust, et
saavutada joonistel 1 ja 2 oleva leukotsüütide populatsiooniga identne jaotus.
TOIMIMINE
puhtus ja lümfotsütaarne taaste
Puhtust ja lümfotsütaarset taastet on hinnatud vastavalt CDC soovitustele (1). K3EDTA-s võetud 10 terve doonori
veri märgistati monoklonaalsete antikehade CD45-FITC ja CD14-PE seguga. Järgmistes tabelites on toodud taaste
ja puhtuse keskmised väärtused ning eri protseduuride vahemikud.