B59380–AD
104 of 135
•
0,5 mL ili 1 mL PBS bez formaldehida ako će se pripravci analizirati unutar 2 sata.
NAPOMENA: U svim slučajevima, čuvajte pripravke između 2 i 8 °C te zaštićene od sunčeve svjetlosti.
B – Postupak bez istovremene fiksacije
Priprema reagensa
Na improviziran način pripremite mješavinu za “Fiksiranje-i -liziranje” dodavanjem 25 µL NERAZRIJEĐENE IOTest
3 10X* fiksacijske otopine (Ref. A07800) u 1mL VersaLyse.
Snažno provrtite epruvete u mješalici 3 do 5 sekundi.
(*) NB: u kontekstu mješavine za “Fiksiranje-i- liziranje“ koristi se IOTest 3 fiksacijska otopina (Ref. A07800) u
četrdeset puta koncentriranijoj otopini, a ne kao 10X otopina (nominalna koncentracija).
Pripremite dovoljnu količinu mješavine za “Fiksiranje-i liziranje“ ovisno o broju uzoraka koji će se lizirati (1 mL
mješavine po epruveti).
Za svaki analizirani uzorak, potrebna je još jedna epruveta s kontrolom uz epruvetu s uzorkom koji se testira, u
kojoj su stanice izmiješane s izotipnom kontrolom koja je u skladu odabranog specifičnog bojenja.
1. U svaku epruvetu s uzorkom za testiranje dodajte količinu antitijela koju preporučuje proizvođač za bojenje 5
x 10
5
leukocita.
2. U svaku epruvetu s kontrolom dodajte količinu izotipne kontrole koju preporučuje proizvođač za bojenje 5 x
10
5
leukocita.
3. Dodajte 100 µL uzorka (prethodno razrijeđenog ili drugačijeg) u obje epruvete. Pažljivo provrtite epruvete u
mješalici.
4. Inkubirajte prateći uvjete postavljene u tehničkim uputama za antitijela koja se koriste.
5. Dodajte 1 mL mješavine za “fiksaciju-i-lizu” te odmah provrtite u mješalici 1 sekundu.
6. Inkubirajte najmanje 10 minuta na sobnoj temperaturi (18 – 25 °C), zaštićeno od svjetlosti.
U slučaju postupka bez ispiranja, epruvete su spremne za citometrijsku analizu.
NB: ako pripravke treba isprati, nemojte ih analizirati prije obavljanja 7. do 11. koraka.
7. Centrifugirajte 5 minuta pri 150 x g na sobnoj temperaturi.
8. Aspiracijom uklonite supernatant.
9. Resuspendirajte stanični sediment s 3 mL PBS.
10. Centrifugirajte 5 minuta pri 150 x g na sobnoj temperaturi.
11. Uklonite supernatant aspiracijom te ponovno pretvorite stanična zrnca u suspenziju u 0,5 mL ili 1 mL PBS-a
plus 0,1 % formaldehida ako se pripravci moraju držati manje od 24 sata. (0,1-postotni formaldehidni PBS
može se postići razrjeđivanjem 12,5 µL fiksativne otopine IOTest 3 (REF A07800) koncentracije 10 x u 1 mL
PBS-a).
Ovi se pripravci trebaju čuvati 24 sata između 2 i 8 °C te zaštićeni od sunčeve svjetlosti.
ANTIKOAGULANS
Trikalijeva sol EDTA (K3EDTA) daje najbolje rezultate, neovisno o korištenoj metodologiji, s ili bez ispiranja nakon
liziranja.
ACD i heparin daju dobre rezultate kod svih postupaka izuzev postupka bez istovremene fiksacije kada ju slijedi
ispiranje.
S ovim antikoagulansima, preporučujemo postupak s istovremenom fiksacijom nakon koje slijedi
ispiranje.
ANALIZA
Rezidue eritrocita mogu povećati difrakcijski signal svjetla pod malim kutem (veličina ili FS) tako da je veći od onog
dobivenog s drugim komercijalnim reagensima za liziranje. Kao rezultat, uobičajeno podešavanje (ili fiksiranje
prema standardu) ("granični prag") diskriminatora na ovom parametru može biti preslabo za VersaLyse.
Stoga se savjetuje podesiti citometar tijekom prvih trenutaka akvizicije tipičnog pripravka. Kod pune lizirane
krvi, preporučuje se prvo progresivno povećati vrijednost diskriminatora dok su populacije leukocita vidljive na
histogramu FS tipa u odnosu na SS ; zatim pažljivo podesite povećavanje FS i SS signala kako bi dobili distribuciju
leukocitne populacije identičnu onoj na slikama 1 i 2.