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de saírem das regiões de condicionamento
(6)
. Uma agitação rigorosa no misturador de tipo vórtice permite
separar estes pares de células.
8. Remova o sobrenadante por aspiração.
9. Ressuspenda o pellet celular utilizando 3 mL de PBS.
10. Centrifugue durante 5 minutos a 150 x g à temperatura ambiente.
11. Retire o sobrenadante por aspiração e ressuspenda o pellet celular utilizando:
•
0,5 mL ou 1 mL de PBS mais 0,1% de formaldeído se as preparações se destinarem a ser mantidas por
menos de 24 horas. (É possível obter uma solução PBS com 0,1% de formaldeído diluindo 12,5 µL da solução
fixadora IOTest 3 [REF A07800] à sua concentração de 10X em 1 mL de PBS).
•
0,5 mL ou 1 mL de PBS sem formaldeido, se as preparações vão ser analisadas em 2 horas.
Nota: Seja qual for o caso, mantenha as preparações entre 2 e 8ºC, protegidas da luz.
B – Procedimento com fixação concomitante
Preparação do reagente
Prepare de forma extemporânea a mistura “Fix-and-Lyse” adicionando 25 µL da Solução de Fixação IOTest 3 10X*
NÃO DILUIDO (Ref. A07800) a 1 mL de VersaLyse.
Agite no vortex os tubos por 3 a 5 segundos.
(*) NB: em relação a mistura “Fix-and-Lyse“, a Solução de Fixação IOTest 3 (Ref. A07800) é utilizada a uma
concentração 40X e não como uma solução 10X (concentração original).
Prepare um volume suficiente da mistura “Fix-and Lyse”, este dependerá do número de amostras a serem lisadas.
Requer de 1 mL de mistura por tubo.
Por cada amostra a analisar requer-se, além do tudo teste, um tubo controlo no qual as células são misturadas
com o controlo isotípico correspondente à coloração específica seleccionada.
1. Adicione a cada tubo teste a quantidade de anticorpo recomendada pelo fabricante para corar 5 x 10
5
leucócitos.
2. Adicione a cada tubo controlo a quantidade de controlo isotípico recomendado pelo fabricante para corar 5
x 10
5
leucócitos.
3. Adicione 100 µL da amostra teste (pré-diluida ou noutra forma) a ambos tubos.
Agite os tubos
cuidadosamente em vórtex.
4. Incube seguindo as condições referidas no folheto técnico dos anticorpos utilizados.
5. Adicione 1 mL da mistura “Fix-and Lyse” e agite no vortex imediatamente por 1 segundo.
6. Incube por pelo menos 10 minutos, à temperatura ambiente (18 – 25 °C), protegido da luz.
No caso do procedimento sem lavagem, os tubos estão prontos para a análise citométrica.
NB: Se as preparações requerem de lavagem, não analise antes de realizar os passos 7 ao 11.
7. Centrifugue durante 5 minutos a 150 x g à temperatura ambiente.
8. Remova o sobrenadante por aspiração.
9. Ressuspenda o pellet celular utilizando 3 mL de PBS.
10. Centrifugue durante 5 minutos a 150 x g à temperatura ambiente.
11. Aspire o sobrenadante e suspenda novamente o precipitado celular em 0,5 mL ou 1 mL de PBS mais 0,1%
de formaldeído se as preparações se destinarem a ser mantidas por menos de 24 horas. (É possível obter
uma solução PBS com 0,1% de formaldeído diluindo 12,5 µL da solução fixadora IOTest 3 [REF A07800] à
sua concentração de 10X em 1 mL de PBS).
Estas preparações podem ser mantidas durante 24 horas entre 2 e 8ºC, protegidas da luz.
ANTICOAGULANTE
O sal tripotássico de EDTA (K3EDTA) da os melhores resultados, independentemente da metodologia utilizada,
com ou sem lavagem após a lise.
O ACD e a heparina dão bons resultados com todos os procedimentos excepto com o procedimento sem fixação
concomitante, quando é seguida de lavagem. Com estes anticoagulantes, recomenda-se o procedimento com
fixação concomitante, seguido de lavagem.