B59380–AD
115 of 135
• 0,5 ml sau 1 ml de PBS plus 0,1% formaldehidă dacă preparatele trebuie păstrate mai puțin de 24 de ore. (O soluție
PBS cu 0,1% formaldehidă poate fi obținută prin diluarea unei cantități de 12,5 µl de soluție de fixare IOTest 3 (REF
A07800) la concentrația de 10X în 1 ml de PBS).
• . 0,5 ml sau 1 ml de PBS fără formaldehidă dacă preparatele trebuie analizate în decurs de 2 ore.
Observație: în toate cazurile, păstrați preparatele la temperaturi cuprinse între 2°C și 8°C și în locuri ferite de lumină.
B – Procedura cu fixare concomitentă
Pregătirea reactivului
Pregătiți imediat amestecul „fixare și lizare” adăugând 25 µl de soluție de fixare NEDILUATĂ IOTest 3 10X* (REF A07800)
la 1 ml de VersaLyse.
Amestecați eprubetele în agitatorul vortex timp de 3–5 secunde.
(*) NB: în contextul amestecului „fixare și lizare”, soluția de fixare IOTest 3 (REF A07800) este utilizată ca soluție concentrată
40X, nu ca soluție 10X (concentrație nominală).
Preparați un volum suficient de amestec „fixare și lizare” în funcție de numărul de probe de lizat (1 ml de amestec per
eprubetă).
Pentru fiecare probă analizată este necesară, pe lângă eprubeta de testare, o eprubetă de control în care celulele sunt
amestecate cu serul de control izotipic corespunzător colorării specifice selectate.
1. Adăugați în fiecare eprubetă cantitatea de anticorpi recomandată de către producător pentru colorarea a 5 x
10
5
leucocite.
2. Adăugați în fiecare eprubetă de control cantitatea de ser de control izotipic recomandată de către producător pentru
colorarea a 5 x 10
5
leucocite.
3. Adăugați 100 µl de probă (prediluată sau altfel) în ambele eprubete. Amestecați cu grijă eprubetele în agitatorul
vortex.
4. Incubați respectând condițiile specificate în prospectul tehnic pentru anticorpii utilizați.
5. Adăugați 1 ml de soluție „fixare și lizare” și amestecați imediat în agitatorul vortex timp de 1 secundă.
6. Incubați timp de 10 minute la temperatura camerei (18°C–25°C) într-un loc ferit de lumină.
În cazul unei proceduri fără spălare, eprubetele sunt pregătite pentru analiza citometrică.
NB: dacă preparatele trebuie spălate, nu analizați înainte de a efectua pașii 7–11.
7. Centrifugați timp de 5 minute la 150 x g la temperatura camerei.
8. Îndepărtați supernatantul prin aspirare.
9. Resuspendați peleta de celule în 3 ml de PBS.
10. Centrifugați timp de 5 minute la 150 x g la temperatura camerei.
11. Îndepărtați supernatantul prin aspirare și resuspendați peleta de celule în 0,5 ml sau 1 ml de PBS plus 0,1% of
formaldehidă dacă preparatele trebuie păstrate mai puțin de 24 de ore. (O soluție PBS cu 0,1% formaldehidă poate
fi obținută prin diluarea unei cantități de 12,5 µl de soluție de fixare IOTest 3 (REF A07800) la concentrația de 10X
în 1 ml de PBS).
Aceste preparate pot fi păstrate timp de 24 de ore la o temperatură cuprinsă între 2°C și 8°C și neexpuse la lumină.
ANTICOAGULANT
Sarea tripotasică de EDTA (K3EDTA) dă cele mai bune rezultate indiferent de metoda utilizată: cu sau fără spălare după
liză.
ACD și heparina dau rezultate bune cu toate procedurile, cu excepția procedurii fără fixare concomitentă urmată de
spălare. Cu aceste coagulante, recomandăm procedura cu fixare concomitentă urmată de spălare.
ANALIZĂ
Reziduurile eritrocitare pot genera un semnal de difracție a luminii dispersate pe direcția înainte (FS) mai mare decât cel
obținut cu alți reactivi de liză comerciali. În consecință, ajustarea obișnuită (sau, implicit, cea fixă) a discriminatorului
(„pragului”) pentru acest parametru poate fi prea mică pentru reactivul VersaLyse.
Prin urmare, este recomandabil să reglați citometrul în primele momente ale achiziției unui preparat tipic. În cazul unei
probe de sânge integral, de exemplu, este recomandabil ca mai întâi să creșteți progresiv valoarea discriminatorului până
când populațiile de leucocite sunt vizibile pe histograma FS vs. SS, iar apoi să ajustați cu atenție amplificarea semnalelor
FS și SS pentru a obține o distribuție a populațiilor de leucocite identică celei din figurile 1 și 2.