B59380–AD
125 of 135
B — procedūra ar vienlaikus fiksāciju
Reaģenta sagatavošana
Iepriekš sagatavojiet fiksēšanas un lizēšanas maisījumu, 25 µl NEATŠĶAIDĪTA IOTest 3 10X* fiksatīvā šķīduma (REF A07800)
pievienojot 1 ml VersaLyse.
3–5 sekundes saskaliniet stobriņus.
(*) Fiksēšanas un lizēšanas maisījuma kontekstā IOTest 3 fiksatīvais šķīdums (REF A07800) tiek izmantots četrdesmitkārtīgi
koncentrētā šķīdumā, nevis kā 10x šķīdums (nominālā koncentrācija).
Sagatavojiet pietiekamu fiksēšanas un lizēšanas maisījuma tilpumu, kas atkarīgs no lizējamo paraugu skaita (1 ml maisījuma
vienam stobriņam).
Katram analizētajam paraugam papildus parauga stobriņam nepieciešams izmantot vienu kontroles stobriņu, kurā šūnas
tiek sajauktas ar izotipēšanas kontroli atbilstoši konkrētajai atlasītajai krāsvielai.
1. Katrā stobriņā pievienojiet ražotāja ieteikto antivielu daudzumu, lai iekrāsotu 5x10
5
leikocītus.
2. Katrā kontroles stobriņā pievienojiet ražotāja ieteikto izotipēšanas kontroles daudzumu, lai iekrāsotu 5x10
5
leikocītus.
3. Ievadiet abos stobriņos 100 µl parauga (iepriekš šķīdināta vai nešķīdināta). Saudzīgi saskaliniet stobriņus.
4. Inkubējiet apstākļos, kas ir norādīti izmantoto antivielu tehniskajā lietošanas instrukcijā.
5. Pievienojiet 1 ml fiksēšanas un lizēšanas maisījuma maisījuma un nekavējoties saskaliniet 1 sekundi.
6. Inkubējiet vismaz 10 minūtes istabas temperatūrā (18–25 °C), sargājot no gaismas.
Ja notiek procedūra bez skalošanas, stobriņi ir gatavi citometrijas analīzei.
NB! Ja sagataves ir jāskalo, neveiciet analīzi pirms 7.–11. darbības izpildes.
7. Centrifugējiet 5 minūtes istabas temperatūrā, izmantojot 150 x g.
8. Aspirējot noņemiet virsējo slāni.
9. Atkārtoti šķaidiet šūnu centrifugātu ar 3 ml PBS.
10. Centrifugējiet 5 minūtes istabas temperatūrā, izmantojot 150 x g.
11. Aspirējot noņemiet virsējo slāni un atkārtoti šķaidiet šūnu koncentrātu, izmantojot 0,5 ml vai 1 ml PBS ar 0,1 %
formaldehīda, ja sagataves tiks uzglabātas mazāk nekā 24 stundas. (0,1 % formaldehīda PBS var iegūt, 1 ml PBS
šķīduma izšķīdinot 12,5 µl IOTest 3 fiksēšanas šķīdumā (REF. A07800) 10 x koncentrācijā).
Šīs sagataves var uzglabāt 24 stundas 2–8 °C temperatūrā, sargājot no gaismas.
ANTIKOAGULANTI
EDTA (K3EDTA) trikālija sāls nodrošina labāko rezultātu neatkarīgi no izmantotās metodes (ar skalošanu pēc lizēšanas vai
bez tās).
ACD un heparīnam bija labi rezultāti visās procedūrās, izņemot procedūru bez vienlaikus fiksācijas, ja pēc tās notiek
skalošana. Darbā ar šiem antikoagulantiem ieteicams izmantot procedūru ar vienlaikus fiksāciju, pēc kuras notiek
skalošana.
ANALĪZE
Eritrocītu paliekas par izraisīt šaurā leņķa gaismas (priekšējā izkliede jeb FS) difrakcijas signālu, kas ir ir lielāks nekā tas,
kas iegūts ar citiem tirgū pieejamiem lizēšanas reaģentiem. Rezultātā parastā jeb pēc noklusējumā fiksētā („sliekšņa”)
diskriminatora regulēšana šim parametram, izmantojot VersaLyse, var būt nepietiekama.
Šī iemesla dēļ ir ieteicams noregulēt citometru pirmajos mirkļos pēc tipiskas sagataves iegūšanas. Lizētu pilnasiņu
gadījumā, piemēram, ir ieteicams vispirms progresējošā secībā palielināt diskriminatora vērtību, līdz leikocītu populācijas
ir redzamas FS, nevis SS tipa histogrammā. Pēc tam ir uzmanīgi jāregulē FS un SS signālu amplifikācija, lai panāktu
leikocītisko populāciju izkliedi, kas ir identiska 1., 2. un 3. attēlā redzamajai.
VEIKTSPĒJA
tīrība un limfocītu atjaunošanās
Tīrība un limfocītu atjaunošanās ir novērtēta saskaņā ar CDC rekomendācijām (1). 10 veselu donoru asinis, kuru paraugi
ņemti K3EDTA stobriņos, tika marķētas ar monoklonālo antivielu CD45-FITC un CD14-PE maisījumu. Atjaunošanās un
tīrības vidējās vērtības, kā arī dažādo procedūru diapazons ir norādīts tālāk redzamajās tabulās.