B59380–AD
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8. Eliminare il surnatante tramite aspirazione.
9. Risospendere il pellet (fondello) cellulare in 3 mL di PBS.
10. Centrifugare per 5 minuti a 150 x g e a temperatura ambiente.
11. Eliminare il surnatante tramite aspirazione e risospendere il pellet cellulare in:
•
0,5 mL o 1 mL di PBS più 0,1% di formaldeide, se i preparati devono essere conservati meno di 24 ore.
(È possibile ottenere PBS con formaldeide allo 0,1% diluendo 12,5 µL di soluzione fissante IOTest 3 (REF
A07800) alla concentrazione di 10x in 1 mL di PBS).
•
0,5 o 1 mL di PBS senza formaldeide, se i preparati devono essere analizzati entro 2 ore.
N.B.: In ogni caso, conservare i preparati a una temperatura compresa tra i 2 e gli 8 °C e al riparo dalla luce.
B – Procedura con fissaggio concomitante
Preparazione del reagente
Preparare estemporaneamente la miscela “Fix-and-Lyse“ aggiungendo 25 µL di Soluzione Fissante IOTest 3 10X*
NON DILUITA (Rif. A07800) a 1 mL di VersaLyse.
Agitare su vortex per 3 - 5 secondi.
(*) N.B.: nell’ambito della miscela “Fix-and-Lyse“, la Soluzione Fissante IOTest 3 (Rif. A07800) è utilizzata come
una soluzione quaranta volte concentrata e non come una soluzione 10X (concentrazione nominale).
Preparare un volume sufficiente di miscela “Fix-and-Lyse“, secondo il numero di campioni da sottoporre a lisi, nella
misura di 1 mL per provetta.
Per ogni campione analizzato, è necessario prevedere, oltre alla provetta test, 1 provetta di controllo nella quale
saranno messe le cellule in presenza del controllo isotipico corrispondendo alla marcatura specifica scelta.
1. In ogni provetta test, aggiungere la quantità di anticorpi raccomandata dal produttore al fine di marcare 5 x
10
5
leucociti.
2. In ogni provetta di controllo, aggiungere la quantità di controllo isotipico raccomandata dal produttore al fine
di marcare 5 x 10
5
leucociti.
3. Aggiungere 100 µL del campione da testare (prediluito o normale) nelle 2 provette. Agitare delicatamente al
vortex.
4. Incubare secondo le istruzioni indicate nella scheda tecnica degli anticorpi utilizzati.
5. Aggiungere 1 mL di miscela “Fix-and-Lyse“ e agitare immediatamente per 1 secondo.
6. Incubare almeno 10 minuti a temperatura ambiente (18 – 25 °C) e al riparo dalla luce.
In caso di procedura senza lavaggio, le provette sono pronte per l’analisi al citometro.
N.B.: Se fosse necessario lavare i preparati, non procedere all’analisi prima di aver eseguito i punti da 7 a 11
riportati di seguito.
7. Centrifugare per 5 minuti a 150 x g e a temperatura ambiente.
8. Eliminare il surnatante tramite aspirazione.
9. Risospendere il pellet (fondello) cellulare in 3 mL di PBS.
10. Centrifugare per 5 minuti a 150 x g e a temperatura ambiente.
11. Eliminare il surnatante mediante aspirazione e risospendere il pellet cellulare in 0,5 mL o 1 mL di PBS più
0,1% di formaldeide, se i preparati devono essere conservati meno di 24 ore. (È possibile ottenere PBS con
formaldeide allo 0,1% diluendo 12,5 µL di soluzione fissante IOTest 3 (REF A07800) alla concentrazione di
10x in 1 mL di PBS).
I preparati possono essere conservati per 24 ore a una temperatura compresa tra i 2 e gli 8 °C e al riparo
dalla luce.
ANTICOAGULANTE
Il sale tripotassico di EDTA (K3EDTA), indipendentemente dal metodo impiegato, con o senza lavaggio dopo la
lisi, fornisce i migliori risultati.
L’ACD e l’eparina forniscono ottimi risultati con tutte le procedure, tranne quella senza fissaggio concomitante
quando è seguita da un lavaggio. Con tali anticoagulanti, raccomandiamo la procedura con fissaggio concomitante,
seguita da un lavaggio.