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ANÁLISE
Os resíduos de eritrócitos podem originar uma maior difracção do sinal do estreito ângulo de luz (“Forward Scatter“
ou FS) que a obtida com outros reagentes comercias de lise. Como resultado, o ajustamento usual (ou fixação
por revelia) do discriminador (“limiar“ ou “treshhold”) sobre este parâmetro pode ser fraco para o VersaLyse.
É deste modo recomendável, ajustar o citómetro durante os primeiros momentos da aquisição numa preparação
típica. No caso de uma amostra de sangue lisado total, por exemplo, é recomendável incrementar primeiro o
valor do discriminador progresivamente até que a população dos leucócitos seja visível sobre um histograma do
tipo FS versus SS ; e então depois, ajustar cuidadosamente a amplificação dos sinais FS e SS para obter uma
distribuição da população dos leucócitos idêntica à das figuras 1 e 2.
DESEMPENHO
Pureza e recuperação linfocítica
A pureza e a recuperação linfocítica têm sido avaliadas conforme as recomendações do CDC (1). O sangue de
10 dadores saudáveis, com amostragem com K3EDTA, foi duplamente marcado com uma mistura de anticorpos
monoclonais CD45-FITC e CD14-PE. As médias da recuperação e pureza, assim como também os valores
extremos para os diferentes procedimentos são dados nas tabelas a seguir:
Sem lavagem
Sem fixação concomitante
Com fixação concomitante
Recuperação
Pureza
Recuperação
Pureza
96,4
92,3
96,6
91,6
95 / 97.5
90.1 / 94.3
95.4 / 98.1
90.1 / 92.6
Com lavagem
Sem fixação concomitante
Com fixação concomitante
Recuperação
Pureza
Recuperação
Pureza
95,6
94,0
96,2
97,2
95 / 97.3
90.3 / 97.3
95.4 / 97.5
92.7 / 99.4
REPRODUTIBILIDADE INTRA-LABORATÓRIO
No mesmo dia e utilizando o mesmo citómetro, foram processadas 31 medições da percentagem de linfócitos
CD3+, sobre a mesma amostra (sangue total de um dador saudável). O procedimento de lise utilizado foi com
fixação concomitante sem lavagem. Os resultados obtidos apresentam-se na seguinte tabela:
Sangue Total
Número
Média (%)
DP
CV (%)
CD3+ Linfócitos
31
60,72
1,61
2,7
LIMITAÇÕES
1. A citometria de fluxo pode produzir falsos resultados se o citómetro não for alinhado perfeitamente, se o
escape de fluorescência não for correctamente compensado e se as regiões não forem cuidadosamente
posicionadas.
2. Resultados seguros e reprodutíveis poderão ser obtidos na medida em que o procedimento usado esteja de
acordo com a técnica descrita no folheto incluído e seja compatível com as boas práticas de laboratório.
3. No caso de um hiperleucocitosis, dilua o sangue em PBS de modo a obter um valor de aproximadamente 5
x 10
9
leucócitos/L (7).
4. No caso de poliglobulinaemia, dilua a amostra em PBS até obter 5 x 10
12
glóbulos vermelhos/L (8, 9, 10).
5. O VersaLyse deve atingir à temperatura ambiente (18 – 25 °C) antes de ser utilizado.
6. Verifique as preparações a olho nu para assegurar a eficácia da lise. Se as mesmas estiverem turvas ou se
os histogramas de difracção da luz forem inusuais, pode indicar que a lise está incompleta.
7. Os eritroblastos podem não estar completamente lisados e aparecem no histograma de difracção de luz na
mesma localização que os leucocitos (11).
8. A Acetazolamida, um inibidor da anidrase carbónica pode inibir complatamente a acção do VersaLyse (12).
9. Em certos estados da doença, como falha renal grave ou hemoglobinopatias, a lise dos glóbulos vermelhos
pode ser lenta, incompleta ou mesmo impossível. Neste caso, é recomendado o isolamento das células
mononucleadas utilizando um gradiente de densidade (Ficoll, por exemplo) antes da coloração (13).