B59380–AD
45 of 135
B – Procedur med samtidig fixering
Preparering av reagens
Vid behov preparera “Fix-and-Lyse” mixtur genom att tillsätta 25 µL av OSPÄDD IOTest 3 10X* Fixative Solution
(Ref. A07800) till 1mL av VersaLyse.
Vortexa rören i 3 till 5 sekunder.
(*) OBS: när det gäller “Fix-and-Lyse“ mixtur, används IOTest 3 Fixative solution (Ref. A07800) i en koncentration
40X lösning och inte som 10X lösning (nominell koncentration).
Preparerera lämplig volym av “Fix-and Lyse” mixtur beroende på antalet prov som ska lyseras (1 mL mixtur per
rör).
För varje analyserat prov behövs, förutom röret med prov, ett kontrollrör i vilket en isotypisk kontroll motsvarande
den specifika inmärkningen sätts till cellerna.
1. Till varje provrör sätts den volym antikropp som rekommenderas av tillverkaren för att märka in 5 x 10
5
leukocyter.
2. Till varje kontrollrör sätts de volym isotypisk kontroll som rekommenderas av tillverkaren för att märka in 5 x
10
5
leukocyter.
3. Tillsätt 100 µL av provet (förspätt eller inte) till båda rören. Vortexa rören försiktigt.
4. Inkubera enligt beskrivning i antikropparnas tekniska produktblad.
5. Tillsätt 1 mL “Fix-and-Lyse“ mixtur och vortexa genast i1sekund.
6. Inkubera minst 10 minuter i rums-temperatur (18 – 25 °C), skyddat för ljus.
Vid procedur utan tvätt är rören färdiga för cytometrisk analys.
OBS: Om preparationerna behöver tvättas, analysera efter steg 7 till 11.
7. Centrifugera i 5 minuter vid 150 x g i rumstemperatur.
8. Avlägsna supernatanten genom aspiration.
9. Resuspendera cellpelleten i 3 mL PBS.
10. Centrifugera i 5 minuter vid 150 x g i rumstemperatur.
11. Avlägsna ytskiktet genom aspiration och återsuspendera cellpelleten med 0,5 mL eller 1 mL av PBS plus
0,1 % formaldehyd om preparaten är avsedda att förvaras mindre än 24 timmar. (En 0,1 % formaldehyd-PBS
kan erhållas genom spädning av 12,5 µL av IOTest 3-fixeringslösning (REF A07800) i dess 10X-koncentration
i 1 mL PBS).
Dessa preparationer kan förvaras 24 timmar mellan 2 och 8 °C skyddat för ljus.
ANTIKOAGULANS
Trikalium EDTA salt (K3EDTA) ger det bästa resultatet oberoende av vilken metod som används, med eller utan
tvätt efter lysering.
ACD och heparin ger bra resultat med alla procedurer, utom den utan samtidig fixering när denna följs av tvätt.
Med dessa antikoagulantia rekommenderar vi proceduren med samtidig fixering, följd av tvätt.
ANALYS
Erytrocytrester kan ge upphov till en större diffraktionssignal av det närvinklade ljuset (“Forward Scatter“ eller FS) än
den som erhålls med andra kommersiella lyseringsreagens. Som ett resultat av detta kan den vanliga inställningen
(eller fixed by default) av tröskeln, (“threshold“) diskriminatorn för denna parameter vara för låg för VersaLyse.
Lysing SolutionDet är därför tillrådligt att justera cytometern under de första ögonblicken av mätning (acquisition)
av en typisk preparering. Till exempel, i ett fall med lyserat helblod, är det lämpligt att gradvis öka värdet på
diskriminatorn tills leukocytpopulationerna blir synliga i ett histogram av typ FS versus SS ; sedan försiktigt justera
förstärkningen av FS och SS signalerna för att erhålla en distribuering av leukocytpopulationerna identisk med dem
i figur 1 och 2.
PRESTANDA
purity och lymfocyt recovery
Purity och lymfocyt recovery har utvärderats enligt rekommendationer från CDC (1). Blodet från 10 friska donatorer
tagna i K3EDTA märktes med en mixtur av monoklonala antikroppar CD45-FITC och CD14-PE. Medelvärden för
recovery och purity så väl som gränserna för de olika procedurerna visas i följande tabeller: