B59380–AD
56 of 135
8. Απαλλαχθείτε από το υπερκείμενο μέσω αναρρόφησης.
9. Εναιωρήστε ξανά το κυτταρικό ίζημα σε 3 mL PBS.
10. Φυγοκεντρίστε στα 150 x g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος.
11. Αφαιρέστε την υπερκείμενη στοιβάδα με αναρρόφηση και επαναιωρήστε το κυτταρικό ίζημα σε 0,5 mL ή 1 mL
PBS συν 0,1% φορμαλδεΰδη, εάν τα παρασκευάσματα πρόκειται να φυλαχθούν για λιγότερο από 24 ώρες.
(Μπορείτε να παρασκευάσετε διάλυμα 0,1% φορμαλδεΰδης/PBS αραιώνοντας 12,5 µL του μονιμοποιητικού
διαλύματος IOTest 3 (REF A07800) 10πλάσιας συγκέντρωσης σε 1 mL PBS).
Τα παρασκευάσματα διατηρούνται 24 ώρες σε θερμοκρασίες μεταξύ 2 και 8 °C και μακριά από εστίες φωτός.
ΑΝΤΙΠΗΚΤΙΚΟ
Το τρικαλιούχο άλας του EDTA (K3EDTA) δίνει, όποια και να είναι η μεθοδολογία που χρησιμοποιείται, με ή χωρίς
πλύση μετά από τη λύση, τα καλύτερα αποτελέσματα.
Το ACD και η ηπαρίνη δίνουν καλά αποτελέσματα με όλες τις διαδικασίες εκτός από τη διαδικασία χωρίς
συνακόλουθη στερεότητα όταν αυτή ακολουθείται από πλύση.
Με αυτά τα αντιπηκτικά, σας συστήνουμε τη
διαδικασία με συνακόλουθη στερεότητα που ακολουθείται από πλύση.
ΑΝΑΛΥΣΗ
Τα κατάλοιπα ερυθροκυττάρων μπορούν να δώσουν ένα σήμα πλάγιας σκέδασης του φωτός (“Forward Scatter“ ή
FS) ανώτερο από αυτό που αποκτάται με άλλα αντιδραστήρια λύσης του εμπορίου. Ως εκ τούτου, η συνηθισμένη
ρύθμιση (ή προεπιλεγμένα ορισμένη) του διακριτή (“threshold“) επ’ αυτής της παραμέτρου μπορεί να αποδειχτεί
πολύ ασθενής για το VersaLyse.
Επομένως συστήνεται η ρύθμιση του κυτταρομετρητή κατά τις πρώτες στιγμές της λήψης ενός τυπικού
παρασκευάσματος. Στην περίπτωση ένος ολικού αίματος που υπέστη λύση, για παράδειγμα, αρμόζει πρώτα η
σταδιακή αύξηση της τιμής του διακριτή ώσπου να γίνουν ορατοί οι λευκοκυτταρικοί πληθυσμοί σε ένα ιστόγραμμα
τύπου FS versus SS . Στη συνέχεια η ακριβής ρύθμιση της ενίσχυσης των σημάτων FS και SS για να επιτευχθεί
μια κατανομή των λευκοκυτταρικών πληθυσμών ίδια με αυτή των εικόνων 1 ή 2.
ΑΠΟΔΟΣΗ
ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΟΜΑΛΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΟΤΗΤΑ
Η ομαλότητα και η καθαρότητα αξιολογήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του CDC (1). Το αίμα 10 υγιών δοτών,
που ελήφθη σε K3EDTA, σημάνθηκε διπλά μέσω ενός μείγματος μονοκλωνικών αντισωμάτων CD45-FITC και
CD14-PE. Ο μέσος όρος των βαθμών ομαλότητας και καθαρότητας καθώς και οι ακραίες τιμές των διάφορων
διαδικασιών δίνονται στους παρακάτω πίνακες:
Χωρίς πλύση
Χωρίς συνακόλουθη στερεότητα
Με συνακόλουθη στερεότητα
Ομαλότητα
Καθαρότητα
Ομαλότητα
Καθαρότητα
96,4
92,3
96,6
91,6
95 / 97,5
90,1 / 94,3
95,4 / 98,1
90,1 / 92,6
Με πλύση
Χωρίς συνακόλουθη στερεότητα
Με συνακόλουθη στερεότητα
Ομαλότητα
Καθαρότητα
Ομαλότητα
Καθαρότητα
95,6
94,0
96,2
97,2
95 / 97,3
90,3 / 97,3
95,4 / 97,5
92,7 / 99,4
ΕΝΔΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΕΠΑΝΑΛΗΨΙΜΟΤΗΤΑ
Την ίδια ημέρα και μέσω του ίδιου κυτταρομετρητή ροής πραγματοποιήθηκαν 31 προσδιορισμοί του ποσοστού
λεμφοκυττάρων CD3+ στο ίδιο δείγμα (ολικό αίμα ενός υγιούς δότη). Η διαδικασία χρήσης που χρησιμοποιήθηκε
είναι αυτή με συνακόλουθη στερεότητα και απουσία πλύσης. Τα αποτελέσματα που εξήχθησαν ομαδοποιήθηκαν
στον παρακάτω πίνακα:
Ολικό αίμα
Αριθμός
ΜΟ (%)
SD
CV (%)
Λεμφοκ. CD3+
31
60,72
1,61
2,7
ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ
1. Τα αποτελέσματα της κυτταρομετρίας ροής μπορεί να είναι λανθασμένα εάν ο κυτταρομετρητής ροής δεν είναι
τέλεια ευθυγραμμισμένος, εάν δεν έχουν ληφθεί σωστά υπόψη οι διαρροές φθορισμού και εάν οι περιοχές
περιορισμού δεν έχουν τοποθετηθεί επιμελώς.