B59380–AD
55 of 135
4. Επωάστε υπό τις συνθήκες που ορίζονται στο τεχνικό δελτίο των χρησιμοποιούμενων αντισωμάτων.
5. Προσθέστε 1 mL VersaLyse και ανακινήστε με vortex για ένα δευτερόλεπτο.
6. Επωάστε για τουλάχιστον 10 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (18 – 25 °C) και μακριά από εστίες φωτός.
Σε περίπτωση διαδικασίας χωρίς πλύση, οι σωλήνες είναι έτοιμοι για την κυτταρομετρική ανάλυση.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν τα παρασκευάσματα πρέπει να υποστούν πλύση, μην τα αναλύετε πριν πραγματοποιήσετε
τα παρακάτω 7 έως 11 βήματα.
7. Φυγοκεντρίστε στα 150 x g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος.
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Έχει παρατηρηθεί ότι κατά την εκτέλεση της διαδικασίας της μη συνακόλουθης στερέωσης
με στάδιο πλύσης, κυτταρικά ζεύγη μπορούν να σχηματιστούν, τα οποία είναι γνωστά και ως διαφεύγοντα,
προκαλώντας την πιθανή παραγωγή εσφαλμένων αποτελεσμάτων εξαιτίας της μεταβολής των ιδιοτήτων τους
σκέδασης του φωτός και του γεγονότος ότι διαφεύγουν από τις περιοχές gating
(6)
. Η ισχυρή ανάδευση μπορεί
να αποκολλήσει τα ζεύγη αυτά
8. Απαλλαχθείτε από το υπερκείμενο μέσω αναρρόφησης.
9. Εναιωρήστε ξανά το κυτταρικό ίζημα σε 3 mL PBS.
10. Φυγοκεντρίστε στα 150 x g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος.
11. Απαλλαχθείτε από το υπερκείμενο μέσω αναρρόφησης και εναιωρήστε ξανά το κυτταρικό ίζημα σε:
•
0,5 mL ή 1 mL PBS συν 0,1% φορμαλδεΰδη, εάν τα παρασκευάσματα πρόκειται να φυλαχθούν για λιγότερο
από 24 ώρες. (Μπορείτε να παρασκευάσετε διάλυμα 0,1% φορμαλδεΰδης/PBS αραιώνοντας 12,5 µL του
μονιμοποιητικού διαλύματος IOTest 3 (REF A07800) 10πλάσιας συγκέντρωσης σε 1 mL PBS).
•
0,5 mL ή 1 mL PBS χωρίς φορμαλδεΰδη, αν τα παρασκευάσματα πρόκειται να αναλυθούν μέσα στης 2 ώρες.
Σημειωση: Σε όλες τις περιπτώσεις, διατηρείστε τα παρασκευάσματα σε θερμοκρασίες μεταξύ 2 και 8 °C και
μακριά από εστίες φωτός.
B – Διαδικασία με συνακόλουθη στερεότητα
Προετοιμασία του αντιδραστηρίου
Παρασκευάστε αυτοσχεδίως το μείγμα “Fix-and-Lyse“ προσθέτοντας 25 µL του Στερεωτικού Διαλύματος IOTest 3
10X* ΜΗ ΑΡΑΙΩΜΕΝΟ (Κωδ. A07800) σε 1 mL του VersaLyse.
Ανακινήστε με vortex για 3 έως 5 δευτερόλεπτα.
(*) ΣΗΜΕΙΩΣΗ: στο πλαίσιο του μείγματος “Fix-and-Lyse“, το Στερωτικό Διάλυμα IOTest 3 (Κωδ.
A07800)
χρησιμοποιείται ως ένα διάλυμα συγκεντρωμένο κατά σαράντα φορές και όχι ως ένα διάλυμα 10X (ονομαστική
συγκέντρωση).
Προετοιμάστε ένα επαρκή όγκο μείγματος “Fix-and-Lyse“ σε συνάρτηση με τον αριθμό των δειγμάτων προς λύση,
με βάση 1 mL αυτού του μείγματος ανά σωλήνα.
Για κάθε δείγμα προς ανάλυση, προβλέψτε εκτός του δοκιμαστικού σωλήνα, έναν σωλήνα ελέγχου μέσα στον οποίο
τα κύτταρα θα βρίσκονται υπό την παρουσία του ισοτυπικού ελέγχου που αντιστοιχεί στην επίλεκτη εξειδικευμένη
σήμανση.
1. Σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα εισάγετε την ποσότητα αντισωμάτων που συνίσταται από τον κατασκευαστή για
τη σήμανση 5 x 10
5
λευκοκυττάρων.
2. Σε κάθε σωλήνα ελέγχου, εισάγετε την ποσότητα ισοτυπικού ελέγχου που συνίσταται από τον κατασκευαστή
για να σημάνετε 5 x 10
5
λευκοκύτταρα.
3. Προσθέστε 100 µL του προς εξέταση δείγματος (προαραιωμένο ή μη) στους 2 σωλήνες. Ανακινήστε ελαφρά
με Vortex.
4. Επωάστε υπό τις συνθήκες που ορίζονται στο τεχνικό δελτίο των χρησιμοποιούμενων αντισωμάτων.
5. Προσθέστε 1 mL του μείγματος “Fix-and-Lyse“ και ανακινήστε αμέσως με vortex ένα δευτερόλεπτο.
6. Επωάστε για τουλάχιστον 10 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (18 – 25 °C) και μακριά από εστίες φωτός.
Σε περίπτωση διαδικασίας χωρίς πλύση, οι σωλήνες είναι έτοιμοι για την κυτταρομετρική ανάλυση.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν τα παρασκευάσματα πρέπει να υποστούν πλύση, μην τα αναλύετε πριν πραγματοποιήσετε
τα παρακάτω 7 έως 11 βήματα.
7. Φυγοκεντρίστε στα 150 x g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος.