B59380–AD
44 of 135
NÖDVÄNDIGA MATERIAL SOM INTE INGÅR I SATSEN:
•
Blodprovrör och material nödvändigt för provtagning.
•
Automatpipetter med tillhörande engångsspetsar 10, 20, 100 och 1 000 µL.
•
Provrör i plast.
•
Kalibreringskulor: Flow-Set Fluorospheres (Ref. 6607007).
•
Specifika fluorescerande antikroppar.
•
Isotypiska kontroller.
•
Buffert (PBS: 0.01 M natriumfosfat; 0.145 M natriumklorid; pH 7.2).
•
Fixeringsreagens: till exempel IOTest 3 Fixative Solution (Ref. A07800).
•
Centrifug.
•
Automatisk blandare (Vortex typ).
•
Flödescytometer.
PROCEDUR med VERSALYSE-REAGENS
OBS: Följande procedur gäller för standard applikationer. Prov och/eller VersaLyse volymer för speciella Beckman
Coulter applikationer kan vara olika. Om så är fallet, följ instruktionerna på applikationens produktblad.
A – Procedur utan samtidig fixering
Preparering av reagens
Ingen preparering är nödvändig. Använd VersaLyse direkt från flaskan.
För varje analyserat prov behövs, förutom röret med prov, ett kontrollrör i vilket en isotypisk kontroll motsvarande
den specifika inmärkningen sätts till cellerna.
1. Till varje provrör sätts den volym antikropp som rekommenderas av tillverkaren för att märka in 5 x 10
5
leukocyter.
2. Till varje kontrollrör sätts de volym isotypisk kontroll som rekommenderas av tillverkaren för att märka in 5 x
10
5
leukocyter.
3. Tillsätt 100 µL av provet (förspätt eller inte) till båda rören. Vortexa rören försiktigt.
4. Inkubera enligt beskrivning i antikropparnas tekniska produktblad.
5. Tillsätt 1 mL VersaLyse och vortexa omedelbart i 1 sekund.
6. Inkubera minst 10 minuter i rums-temperatur (18 – 25 °C), skyddat för ljus.
Vid procedur utan tvätt är rören färdiga för cytometrisk analys.
OBS: Om preparationerna behöver tvättas, analysera efter steg 7 till 11.
7. Centrifugera i 5 minuter vid 150 x g i rumstemperatur.
VIKTIGT! Det har visat sig att när man använder proceduren utan samtidig fixering tillsammans med
ett tvättsteg, kan det bildas celldubbletter, benämnda escapees, som eventuellt kan ge upphov till
felaktiga resultat beroende på att deras ljusspridningsegenskaper förändras och att de passerar utanför
gating-regionerna
(6)
. Noggrann vortexblandning kan eventuellt separera dessa dubbletter.
8. Avlägsna supernatanten genom aspiration.
9. Resuspendera cellpelleten i 3 mL PBS.
10. Centrifugera i 5 minuter vid 150 x g i rumstemperatur.
11. Avlägsna supernatanten genom aspiration och resuspendera cellpelleten i:
•
0,5 mL eller 1 mL av PBS plus 0,1 % formaldehyd om preparaten är avsedda att förvaras mindre än 24
timmar. (En 0,1 % formaldehyd-PBS kan erhållas genom spädning av 12,5 µL av IOTest 3-fixeringslösning
(REF A07800) i dess 10X-koncentration i 1 mL PBS).
•
0,5 mL eller 1 mL PBS utan formaldehyd, om preparationerna ska analyseras inom 2 timmar.
OBS: I samtliga fall ska preparationerna förvaras mellan 2 och 8 °C, skyddade från ljus.