B59380–AD
131 of 135
8. Видаліть супернатант аспірацією.
9. Ресуспендуйте осад клітин у 3 мл розчину ФСБ.
10. Центрифугуйте при кімнатній температурі протягом 5 хвилин із прискоренням 150 g.
11. Видаліть супернатант шляхом аспірації й ресуспендуйте осад клітин в 0,5 мл або 1 мл ФСБ з
додаванням 0,1% формальдегіду, якщо препарати повинні зберігатись менше 24 годин.
(0,1%
формальдегіду в розчині ФСБ можна отримати шляхом розведення 12,5 мкл розчину для фіксації
IOTest 3 (Ref. A07800) при його 10X концентрації в 1 мл ФСБ).
Ці препарати можна зберігати протягом 24 годин при температурі 2–8°С в захищеному від світла місці.
АНТИКОАГУЛЯНТ
Трикалієва сіль EDTA (K3EDTA) показує найкращі результати, незалежно від використовуваної методології,
з чи без промивання після лізису.
ACD і гепарин дають хороші результати при проведенні всіх процедур, за винятком процедури без
одночасної фіксації, якщо за нею слідує етап промивання.
За допомогою цих антикоагулянтів ми
рекомендуємо проводити процедуру з одночасною фіксацією з подальшим промиванням.
АНАЛІЗ
Залишки еритроцитів можуть викликати дифракційний сигнал вузькокутового розсіювання світла (прямого
розсіюваня або FS), більший, ніж той, який отримують з іншими доступними на ринку реагентами для лізису.
В результаті, звичайне коригування (або встановленняза замовчуванням) («порога») дискримінатора за цим
параметром може бути занадто слабким для VersaLyse.
Тому рекомендується коригувати цитометр під час перших моментів збору даних типового препарату. тобто,
у випадку лізованої цільної крові, рекомендується спочатку поступово збільшувати значення дискримінатора
до тих пір, поки на гістограмі типу FS у порівнянні з гістограмою типу SS не буде видно популяції лейкоцитів;
потім ретельно відкоригувати посилення сигналів FS та SS для отримання розподілу популяцій лейкоцитів,
ідентичних наведеним на рисунках 1 і 2.
РОБОЧІ ПОКАЗНИКИ
чистота і відновлення лімфоцитів
Чистота та відновлення лімфоцитів оцінювали відповідно до рекомендацій CDC (1). Кров 10 здорових
донорів, відібраних у K3EDTA, маркували сумішшю моноклональних антитіл CD45-FITC та CD14-PE.
Середні значення відновлення та чистоти, а також діапазон для різних процедур наведені в наступних
таблицях:
Без промивання
Без одночасної фіксації
З одночасною фіксацією
Відновлення
Чистота
Відновлення
Чистота
96,4
92,3
96,6
91,6
95 / 97,5
90,1 / 94,3
95,4 / 98,1
90,1 / 92,6
З промиванням
Без одночасної фіксації
З одночасною фіксацією
Відновлення
Чистота
Відновлення
Чистота
95,6
94,0
96,2
97,2
95 / 97,3
90,3 / 97,3
95,4 / 97,5
92,7 / 99,4
ВНУТРІШНЬОЛАБОРАТОРНА ВІДТВОРЮВАНІСТЬ
У той самий день і з використанням того самого цитометра було проведено 31 вимірювання процентного
вмісту лімфоцитів CD3+ на одному зразку (цільна кров, взята у здорового донора). Використана процедура
лізису була одночасною фіксацією за відсутності промивання. Отримані результати підсумовано в наведеній
нижче таблиці.
Цільна кров
Номер
Середнє значення
(%)
СВ
КВ (%)
Лімфоцити
CD3+
31
60,72
1,61
2,7