B60231–AE
77 of 128
WAŻNE:
Jeżeli podczas pipetowania występują pęcherzyki powietrza, istnieje ryzyko uzyskania
błędnych wyników. Nadmierne mieszanie fluorokulek Stem-Count lub Flow-Count
Fluorospheres może spowodować powstanie pęcherzyków powietrza. Nie należy
nadmiernie mieszać fluorokulek Stem-Count lub Flow-Count Fluorospheres i nie należy
pipetować pęcherzyków powietrza do probówek z próbkami.
9. Delikatnie wymieszać fluorokulki Stem-Count lub Flow-Count Fluorospheres odwracając fiolkę 3 do 5 razy
przed użyciem.
Unikać zbyt intensywnego mieszania, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków
powietrza.
10.Przed akwizycją pipetować 100 µL fluorokulek Stem-Count lub Flow-Count Fluorospheres do probówki.
11. Worteksować przez 5 sekund natychmiast po każdym dodaniu. Przechowywać w temperaturze 2–8°C.
Powtarzać worteksowanie bezpośrednio przed akwizycją za pomocą cytometrii przepływowej.
WAŻNE:
Ryzyko błędnych wyników, jeżeli próbka jest analizowana ponad 1 godzinę po dodaniu
fluorokulek Stem-Count lub Flow-Count Fluorospheres. Przygotowane próbki muszą
być analizowane w ciągu 1 godziny od dodania fluorokulek Stem-Count lub Flow-Count
Fluorospheres.
Podsumowanie przygotowania (Etykieta probówki: TROL45/34/7-AAD)
Odczynniki i próbki
Objętość
CD45-FITC / CD34-PE
20 µL
7-AAD barwnik określający żywotność
20 µL
Krew pełna
100 µL
Stem-Trol Control Cells
20 µL
Worteksować — Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Chronić przed
światłem
1X NH
4
Cl Lysing Solution
2 mL
Worteksować — Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Chronić przed
światłem
Stem-Count Fluorospheres
100 µL
BRAMKOWANIE MANUALNE I METODA ANALIZY
Konfiguracja protokołu
Cytometr przepływowy musi być wyposażony w możliwość detekcji rozpraszania do przodu, rozpraszania
bocznego oraz czterech kanałów fluorescencji. Dla kanału FL3 (do monitorowania wartości Stem-Count lub
Flow-Count Fluorospheres) użyć filtra środkowoprzepustowego 620 nm.
Dla kanału FL4 (do monitorowania
barwnika żywotności 7-AAD) użyć filtra długich częstotliwości 675 nm.
UWAGA:
Ten sam schemat bramkowania i seria 8 histogramów jak podane dla analizy
próbek musi być przestrzegany dla komórek kontrolnych Stem-Trol Control Cells.
Ponieważ komórki kontrolne Stem-Trol Control Cells mają zbliżoną charakterystykę
rozmiaru i ekspresję antygenów CD45 oraz CD34 przy gęstościach, które są zbliżone
do prawidłowych, niedojrzałych komórek hematopoetycznych, nie ma potrzeby
modyfikowania granic regionu wraz z kanałami rozpraszania do przodu, fluorescencji 1
oraz fluorescencji 2. Jednak ponieważ charakterystyka rozpraszania bocznego komórek
kontrolnych Stem-Trol Control Cells jest unikatowa, można dostosować granice regionu
wraz z rozpraszaniem bocznym. Regiony A, B, C oraz D (definiowanie regionu, patrz
nagłówek Tworzenie regionu) muszą być modyfikowane w celu uwzględnienia klastra
charakterystyki komórek kontrolnych Stem-Trol Control Cells.
Tworzenie histogramu:
Utworzyć histogramy w następujący sposób:
1. Tworzenie Histogramu 1 jako FL1 CD45-FITC wobec rozpraszania bocznego.
2. Tworzenie Histogramu 2 jako FL2 CD34-PE wobec rozpraszania bocznego.
3. Tworzenie Histogramu 3 jako FL1 CD45-FITC wobec rozpraszania bocznego.
