B60231–AE
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IMPORTANTE:
Existe riesgo de resultados erróneos si se pipetean burbujas de aire. La mezcla en
exceso de Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres puede provocar la formación de
burbujas de aire. Evite mezclar en exceso las Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres
y no pipetee las burbujas de aire dentro de los tubos de muestra que contienen los
tubos de muestra.
9. Mezcle suavemente las Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres dando vuelta al frasco de 3 a 5 veces antes
de su utilización. Evite mezclar en exceso a fin de reducir al máximo la formación de burbujas de aire.
10.Antes de la adquisición, pipetee 100 µL de Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres en el tubo de muestra.
11. Mezcle en vórtex durante 5 segundos inmediatamente después de cada adición. Conserve a una temperatura
entre 2 y 8 °C. Repita la mezcla en vórtex inmediatamente antes de cada adquisición por citometría de flujo.
IMPORTANTE:
Existe un riesgo de resultados erróneos si las muestras se analizan más de una
hora después de añadir las Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres. Las muestras
preparadas deben de analizarse dentro de una hora después de añadir las Stem-Count
o Flow-Count Fluorospheres.
Resumen de la preparación (Etiqueta del tubo de muestra: TROL45/34/7-AAD)
Reactivos y muestras
Volumen
CD45-FITC / CD34-PE
20 µL
Colorante 7-AAD - Viabilidad celular
20 µL
Sangre entera
100 µL
Stem-Trol Control Cells
20 µL
Vórtex – Incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Protéjase de la luz
1X NH
4
Cl Lysing Solution
2 mL
Vórtex – Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Protéjase de la luz
Stem-Count Fluorospheres
100 µL
MÉTODO MANUAL DE DELIMITACIÓN DE LAS VENTANAS Y DE ANÁLISIS
Configuración del protocolo de análisis
El citómetro de flujo debe estar equipado para detectar dispersión de luz frontal, dispersión lateral de luz y cuatro
canales de fluorescencia. Para el canal FL3 (para la detección de las Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres)
utilice un filtro band pass 620 nm. Para el canal FL4 (para la detección del marcador de viabilidad 7-AAD) utilice
un filtro long pass 675 nm.
NOTA:
En el caso de las Stem-Trol Control Cells, debe aplicarse el mismo método de análisis
de ventanas y la serie de 8 histogramas tal y como se indica para el análisis de
muestras. Dado que las Stem-Trol Control Cells tienen características de tamaño
similares y expresan los antígenos CD45 y CD34 con densidades parecidas a las
células hematopoyéticas inmaduras normales, no hay necesidad de modificar los
contornos de la región a lo largo de la dispersión de luz frontal y los canales de
fluorescencia 1 y 2. Sin embargo, puesto que las características de la dispersión lateral
de las Stem-Trol Control Cells son singulares, se pueden ajustar los contornos de la
región en la dispersión lateral. Las regiones A, B, C y D (para conocer la definición de
una región, consulte la sección Creación de las regiones) se deben modificar para incluir
las características de agrupamiento de las Stem-Trol Control Cells.
Creación de los Histogramas:
Cree histogramas del modo siguiente:
1. Crear un Histograma 1 con FL1 CD45-FITC frente a dispersión lateral de luz.
2. Crear un Histograma 2 con FL2 CD34-PE frente a dispersión lateral de la luz.
3. Crear un Histograma 3 con FL1 CD45-FITC frente a dispersión lateral de luz.
4. Crear un Histograma 4 con dispersión frontal de luz frente a dispersión lateral de luz.
5. Crear un Histograma 5 con FL1 CD45-FITC frente a FL2 CD34-PE.
6. Crear un Histograma 6 con dispersión frontal frente a dispersión lateral.
