B60231–AE
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7. Crear un Histograma 7 correspondiente a Tiempo frente a FL3 Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres.
8. Crear un Histograma 8 con FL4 7-AAD frente a dispersión lateral.
Los Histogramas de 1 a 4 están destinados a caracterizar las células CD34
+
HPC, un proceso que puede retrasarse
hasta la fase de análisis. Estos cuatro primeros histogramas están definidos de acuerdo con las Directrices
ISHAGE relativas a caracterización de las células CD34
+
por citometría de flujo (2,3).
Los histogramas del 5 al 7 están destinados a monitorizar parámetros que son de importancia durante la etapa de
adquisición. Esto incluye el discriminador de la dispersión frontal, el número de eventos CD45
+
que debe recogerse
y la acumulación correcta de singletes de fluoroesfera.
El histograma 8 se destina a distinguir y a analizar los eventos viables de los no viables cuando es necesario.
Creación de las Regiones
Crear regiones del modo siguiente:
1. Histograma 1 – Crear la Región A rectilínea que incluya todos los leucocitos CD45
+
y excluya las plaquetas,
residuos de eritrocitos y agregados.
2. Histograma 1 – Crear la Región E amorfa sobre los linfocitos (CD45 brillantes, baja dispersión lateral).
3. Histograma 2 – Crear la Región B rectilínea en el Histograma 2 que incluya todos los eventos CD34
+
con una
dispersión lateral de baja a intermedia. Detener el recuento en los 75 000 eventos (CD45
+
) in Histograma 2.
4. Histograma 3 – Crear la Región C amorfa en el Histograma 3 con el fin de incluir todos los eventos CD45
dim
agrupados.
5. Histograma 4 – Crear la Región D amorfa en el Histograma 4 para incluir todos los eventos agrupados con
dispersión lateral (side scatter) intermedia y dispersión frontal (forward scatter) de intermedia a alta.
6. Histograma 5 – Crear la Región I Quadstat en el Histograma 5 para verificar el límite inferior de la expresión
de CD45 en los eventos CD34
+
.
7. Histograma 5 – Crear la Región H amorfa en el Histograma 5 que englobe todas las Stem-Count o Flow-Count
Fluorospheres, incluidos los dobletes. La Región H se debe situarse en el ángulo superior derecho del
Histograma 5.
NOTA:
Asegúrese de que la Región H esté diseñada como una región AMORPHOUS
(AMORFA).
8. Histograma 6 – Copiar la Región D del Histograma 4 como Región F en el Histograma 6.
9. Histograma 7 – Crear la Región G rectilínea en el Histograma 7 que incluya solo los singletes de las
Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres.
La Región G puede etiquetarse como «CAL» para permitir
el cálculo automático de la numeración absoluta de células CD34
+
HPC (para obtener información
complementaria, consulte el manual del instrumento).
10.Histograma 8 – Crear la Región J rectilínea en el Histograma 8 para separar los leucocitos viables (eventos
negativos 7- AAD) de los eventos no viables (principalmente Stem-Trol Control Cells positivas para el
marcador de viabilidad 7-AAD).
Creación de las Ventanas de Análisis
Crear selecciones de poblaciones del modo siguiente:
1. Histograma 1 – Acondicione el Histograma 1 en la Región “H” para visualizar todos los eventos con exclusión
de las Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres. Consulte el manual del instrumento para la creación de «not
gates » (Sin ventanas de análisis).
2. Histograma 2 – Asignar la región “A” al Histograma 2 con el fin de visualizar todos los eventos CD45
+
.
3. Histograma 3 – Asignar las regiones “A” y“ B ” (AB) al Histograma 3 con el fin de visualizar todos los eventos
CD45
+
CD34
+
.
4. Histograma 4 – Asignar las regiones “A”, “B” y “C” (ABC) al Histograma 4 con el fin de visualizar todos los
eventos CD45
+
CD34
+
y los eventos agrupados con dispersión lateral de baja a intermedia y baja expresión
de tinción de CD45. Los eventos procedentes de la Región ABCD corresponden a las células CD34
+
HPC
verdaderas.
5. Histograma 5 – Sin ventanas de análisis, para mostrar todos los eventos.
6. Histograma 6 – Asignar la Región “E” para mostrar los linfocitos como un control visual en el discriminador.
