B60231–AE
85 of 128
Souhrny preparátu (štítek zkumavky: TROL45/34/7-AAD)
Reagencie a vzorky
Objem
CD45-FITC / CD34-PE
20 µl
7-AAD Viability Dye
20 µl
Plná krev
100 µl
Stem-Trol Control Cells
20 µl
Promíchejte – provádějte inkubaci při pokojové teplotě po dobu 20 minut. Chraňte před
světlem.
1X NH
4
Cl Lysing Solution
2 ml
Promíchejte – provádějte inkubaci při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Chraňte před
světlem.
Stem-Count Fluorospheres
100 µl
RUČNÍ GATOVÁNÍ A METODA ANALÝZY
Nastavení protokolu
Průtokový cytometr musí být vybaven pro detekování přímého rozptylu, kolmého rozptylu a čtyř fluorescenčních
kanálů. Pro kanál FL3 (v případě monitorování přípravků Stem-Count nebo Flow-Count Fluorospheres) použijte
filtr průchodu pro pásmo 620 nm. Pro kanál FL4 (v případě monitorování barviva pro určení životnosti buněk
7-AAD) použijte filtr průchodu pro délku 675 nm.
POZNÁMKA:
Tentýž systém gatování a posloupnost 8 histogramů podle pokynů pro analýzu vzorků
je třeba dodržet pro buňky Stem-Trol Control Cells. Jelikož charakteristika velikosti
buněk Stem-Trol Control Cells se blíží hustotám, které přibližně odpovídají normálním
nezralým hematopoietickým buňkám, a exprimují při nich antigeny CD45 a CD34,
není třeba upravovat hranice oblastí podél kanálů přímého rozptylu, fluorescence 1
a fluorescence 2. Jelikož jsou však charakteristiky kolmého rozptylu buněk Stem-Trol
Control Cells jedinečné, je možné upravovat hranice oblasti podél kolmého rozptylu.
Oblasti A, B, C a D (definice oblastí jsou uvedeny pod nadpisem Vytváření oblastí) musí
být upraveny tak, aby obsahovaly shluk s charakteristikou buněk Stem-Trol Control Cells.
Vytvoření histogramů
Vytvořte histogramy následujícím způsobem:
1. Pomocí parametrů FL1 CD45-FITC vs. Side Scatter (kolmý rozptyl) vytvořte histogram 1.
2. Pomocí parametrů FL2 CD34-PE vs. Side Scatter (kolmý rozptyl) vytvořte histogram 2.
3. Pomocí parametrů FL1 CD45-FITC vs. Side Scatter (kolmý rozptyl) vytvořte histogram 3.
4. Pomocí parametrů Forward Scatter (přímý rozptyl) vs. Side Scatter (kolmý rozptyl) vytvořte histogram 4.
5. Pomocí parametrů FL1 CD45-FITC vs. FL2 CD34-PE vytvořte histogram 5.
6. Pomocí parametrů Forward Scatter (přímý rozptyl) vs. Side Scatter (kolmý rozptyl) vytvořte histogram 6.
7. Pomocí parametrů Time (čas) vs. FL3 Stem-Count nebo Flow-Count Fluorospheres vytvořte histogram 7.
8. Pomocí parametrů FL4 7-AAD vs. Side Scatter (kolmý rozptyl) vytvořte histogram 8.
Histogramy 1 až 4 jsou určeny pro charakterizaci hematopoietických progenitorních buněk (HPC) CD34
+
; provedení
tohoto procesu lze odložit až po provedení kroku analýzy. První čtyři histogramy jsou nastaveny s použitím pokynů
ISHAGE pro určování buněk CD34
+
průtokovou cytometrií (2, 3).
Histogramy 5 až 7 jsou určeny pro monitorování důležitých parametrů během kroku získání. Patří mezi ně
diskriminátor přímého rozptylu, počet událostí CD45
+
, které mají být shromážděny, a správná akumulace singletů
fluorescenčních částic.
Histogram 8 je určen pro diskriminaci a analýzu událostí s určitou životností od událostí bez životnosti, je-li to třeba.
Vytvoření oblastí (regionů)
Následujícím způsobem vytvořte regiony.
1. Histogram 1 – vytvořte přímočarou oblast A, aby byly zahrnuty všechny leukocyty CD45
+
a eliminovaly se
krevní destičky, nečistoty buněk červených krvinek a agregace.
2. Histogram 1 – vytvořte amorfní oblast E pro lymfocyty (jasné zobrazení CD45, nízký kolmý rozptyl).
