B60231–AE
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Cronómetro.
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Citómetro de fluxo.
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Software do sistema stemCXP APENAS para análises automatizadas de Stem-Trol Control Cells em
citómetros de fluxo FC 500 equipados com software CXP.
PROCEDIMENTO
Para obter informações sobre análises automáticas, consulte o stemCXP System Guide (Manual do
sistema stemCXP) fornecido com o software do sistema stemCXP para obter instruções completas.
Para uma análise manual, consulte o folheto informativo de Stem-Kit Reagents e o seguinte procedimento.
NOTA:
Para normalizar a análise, quando receber novos Stem-Kit Reagents, e posteriormente
a intervalos diários, realize uma verificação de processos submetendo a coloração
Stem-Trol Control Cells com uma amostra de sangue periférico normal de um dador
saudável. Além disso, dado que as Stem-Trol Control Cells são células estabilizadas
(ou seja, células não viáveis), a coloração por marcador de viabilidade 7-AAD poderá
ser verificada visualmente nas Stem-Trol Control Cells (consulte o título «Criação de
histogramas»).
Certifique-se de que o citómetro de fluxo está devidamente alinhado e normalizado em termos de intensidade de
fluorescência de acordo com as recomendações do fabricante e do laboratório. Certifique-se de que as definições
de compensação de fluorescência estão devidamente ajustadas de acordo com as recomendações do fabricante
e do laboratório.
Coloque o reagente e os anticorpos de controlo à temperatura ambiente.
Para cada experiência, identifique um tubo de amostra: TROL 45/34/7-AAD.
1. Pipetar 20 µL de CD45-FITC/CD34-PE para o tubo de amostra.
2. Pipete 20 µL de marcador de viabilidade 7-AAD para o tubo de amostra.
IMPORTANTE:
Risco de lise incompleta se um existir espécime de sangue na parte superior ou lateral
do tubo de ensaio. Proceda com cuidado ao pipetar para impedir que o sangue toque
na parte superior ou lateral do tubo de ensaio. Limpe o tubo de amostra com um
cotonete, se necessário, para eliminar todos os vestígios de espécime de sangue das
partes superior ou lateral do tubo de ensaio.
3. Pipete exatamente 100 µL de amostra de sangue total bem misturada para o fundo do tubo de amostra
utilizando uma pipeta calibrada de deslocamento positivo ou repetição.
4. Prepare e adicione Stem-Trol:
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Misture Stem-Trol Control Cells no vortex durante 5 segundos.
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Pipete exatamente 20 µL de Stem-Trol Control Cells para o tubo de amostra.
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Misture os tubos de amostra no vortex durante 5 segundos.
5. Incubar à temperatura ambiente (18 a 25 °C) durante 20 minutos, ao abrigo da luz.
6. Adicione 2 mL de 1X NH
4
Cl Lysing Solution preparada a um tubo de amostra e misture de imediato no vortex
durante 5 segundos.
Para obter mais detalhes sobre a preparação da Lysing Solution, consulte o folheto informativo de Stem-Kit
Reagents.
7. Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos, ao abrigo da luz.
8. Armazene os tubos de amostra numa rack colocada em gelo (2 a 8 °C) e protegidos da luz.
IMPORTANTE:
Risco de resultados errados se forem pipetadas bolhas de ar. Misturar excessivamente
Stem-Count Fluorospheres ou Flow-Count Fluorospheres pode criar bolhas de ar. Não
misturar excessivamente as Stem-Count Fluorospheres ou Flow-Count Fluorospheres
nem pipetar bolhas de ar para os tubos de amostra.
9. Misture cuidadosamente as Stem-Count Fluorospheres ou Flow-Count Fluorospheres invertendo o tubo 3 a
5 vezes antes de utilizar. Evite misturar excessivamente para minimizar a formação de bolhas de ar.
