B60231–AE
100 of 128
Построение гистограмм
Создайте гистограммы следующим образом:
1. Создайте гистограмму 1 как FL1 CD45-FITC относительно бокового рассеяния.
2. Создайте гистограмму 2 как FL2 CD34-PE относительно бокового рассеяния.
3. Создайте гистограмму 3 как FL1 CD45-FITC относительно бокового рассеяния.
4. Создайте гистограмму 4 как прямое рассеяние относительно бокового рассеяния.
5. Создайте гистограмму 5 как FL1 CD45-FITC относительно FL2 CD34-PE.
6. Создайте гистограмму 6 как прямое рассеяние относительно бокового рассеяния.
7. Создайте гистограмму 7 как время относительно FL3 Stem-Count или Flow-Count Fluorospheres.
8. Создайте гистограмму 8 как FL4 7-AAD относительно бокового рассеяния.
Гистограммы 1–4 предназначены для описания гематопоэтических клеток-предшественников CD34
+
, этот
процесс можно отложить до этапа анализа. Эти первые четыре гистограммы настраиваются согласно
ISHAGE Guidelines for CD34+ Cell Determination by Flow Cytometry (Руководство ISHAGE по определению
клеток CD34
+
методом проточной цитометрии) (2,3).
Гистограммы 5–7 предназначены для мониторинга параметров, которые имеют значение на этапе сбора.
Сюда входит дискриминатор прямого рассеяния, количество событий CD45
+
для сбора и правильное
накопление синглетов флуоросфер.
Гистограмма 8 предназначена для дифференциации жизнеспособных и нежизнеспособных событий и
анализа, когда требуется.
Создание регионов
Создайте следующие регионы:
1. Гистограмма 1 — создайте прямолинейный регион A, включающий все лейкоциты CD45
+
и
исключающий тромбоциты, остатки эритроцитов и скопления.
2. Гистограмма 1 — создайте аморфный регион E по лимфоцитам (яркие CD45, низкое боковое
рассеяние).
3. Гистограмма 2 — создайте прямолинейный регион B на гистограмме 2, включающий все события CD34
+
с низким или средним боковым рассеянием. Установите предел подсчета 75 000 событий (события
CD45
+
) на гистограмме 2.
4. Гистограмма 3 — создайте аморфный регион C на гистограмме 3, включающий все объединенные
события CD45
dim
.
5. Гистограмма 4 — создайте аморфный регион D на гистограмме 4, включающий все объединенные
события со средним боковым рассеянием и средним или высоким прямым рассеянием.
6. Гистограмма 5 — создайте квадрант-регион I на гистограмме 5 для проверки нижнего предела
экспрессии CD45 на событиях CD34
+
.
7. Гистограмма 5 — создайте аморфный регион H на гистограмме 5, чтобы окружить все Stem-Count или
Flow-Count Fluorospheres, включая дублеты. Регион H должен быть расположен в верхнем правом углу
гистограммы 5.
ЗАМЕЧАНИЕ:
Убедитесь, что регион H обозначен как регион AMORPHOUS (Аморфный).
8. Гистограмма 6 — копируйте регион D с гистограммы 4 как регион F на гистограмме 6.
9. Гистограмма 7 — создайте прямолинейный регион G на гистограмме 7, включающий только
синглеты Stem-Count или Flow-Count Fluorospheres.
Регион G можно отметить как «CAL»
(Калибровка), чтобы обеспечить автоматический подсчет абсолютного количества гематопоэтических
клеток-предшественников CD34
+
(дополнительные сведения см. в руководстве по инструменту).
10.Гистограмма 8 — создайте прямолинейный регион J на гистограмме 8 для отделения жизнеспособных
лейкоцитов (отрицательные события 7-AAD) от нежизнеспособных событий (преимущественно
контрольных клеток Stem-Trol Control Cells, положительных на окрашивание 7-AAD).
Создание гейтов
Создайте области селекции следующим образом:
