B60231–AE
92 of 128
Hazırlama Özeti (Tüp Etiketi: TROL45/34/7-AAD)
Reaktifler ve Örnekler
Hacim
CD45-FITC / CD34-PE
20 µL
7-AAD Viyabilite Boyası
20 µL
Tam Kan
100 µL
Stem-Trol Control Cells
20 µL
Vorteks – 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Işıktan koruyun
1X NH
4
Cl Lysing Solution
2 mL
Vorteks – 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Işıktan koruyun
Stem-Count Fluorospheres
100 µL
MANUEL GEÇİTLEME VE ANALİZ YÖNTEMİ
Protokol Ayarı
Akış sitometresi; Forward Scatter (Öne Saçılma), Side Scatter (Yana Saçılma) ve dört floresans kanalını
algılayacak donanıma sahip olmalıdır. FL3 kanalı için (Stem-Count veya Flow-Count Fluorospheres izleme için)
620 nm bant geçiş filtresi kullanın. FL4 kanalı için (7-AAD Viability Dye izleme için) 675 nm uzun geçiş filtresi
kullanın.
NOT:
Stem-Trol Control Cells için de numune analizi için belirtilen geçitleme şemasının ve
8 histogramlık serinin aynısı izlenmelidir. Stem-Trol Control Cells normal immatür
hematopoietik hücrelere yakın özelliklere sahip olup yaklaşan yoğunluklarda CD45 ve
CD34 antijenlerini eksprese ettiğinden Forward Scatter (Öne Saçılma), Fluorescence
1 (Floresans 1) ve Fluorescence 2 (Floresans 2) kanalları boyunca bölge sınırlarının
değiştirilmesi gerekli değildir. Ancak, Stem-Trol Control Cells Side Scatter (Yana
Saçılma) özellikleri benzersiz olduğundan Side Scatter (Yana Saçılma) boyunca
bölge sınırlarını ayarlayabilirsiniz. A, B, C ve D bölgeleri (bölge tanımı için Bölge
Oluşturma başlığına bakın) Stem-Trol Control Cells özellik kümesini içerecek şekilde
değiştirilmelidir.
Histogram Oluşturma
Histogramları aşağıdaki gibi oluşturun:
1. FL1 CD45-FITC’ye karşılık Side Scatter (Yan Saçılma) olarak Histogram 1’i oluşturun.
2. FL2 CD34-PE’ye karşılık Side Scatter (Yana Saçılma) olarak Histogram 2’yi oluşturun.
3. FL1 CD45-FITC’ye karşılık Side Scatter (Yan Saçılma) olarak Histogram 3’i oluşturun.
4. Forward Scatter’a (Öne Saçılma) karşılık Side Scatter (Yan Saçılma) olarak Histogram 4’yı oluşturun.
5. FL1 CD45-FITC’ye karşılık FL2 CD34-PE olarak Histogram 5’i oluşturun.
6. Forward Scatter’a (Öne Saçılma) karşılık Side Scatter (Yan Saçılma) olarak Histogram 6’yı oluşturun.
7. Süre - FL3 Stem-Count veya Flow-Count Fluorospheres olarak Histogram 7’yi oluşturun.
8. FL4 7-AAD’ye karşılık Side Scatter (Yan Saçılma) olarak Histogram 8’i oluşturun.
1 ile 4 arasındaki histogramlar, analiz adımına kadar ertelenebilecek CD34
+
HPC işlemini karakterize etmeye
yöneliktir.
Bu ilk dört histogram, Akış Sitometrisi ile CD34
+
Hücre Determinasyonuna Yönelik ISHAGE
Yönergeleri’ne (2,3) uygun olarak ayarlanır.
Histogram 5 ila 7, edinme adımı sırasında önemli olan parametreleri izlemeye yöneliktir. Bunlar Forward Scatter
(Öne Saçılma) ayrıştırıcısını, toplanacak CD45
+
olaylarının sayısını ve doğru florosfer singlet birikimini içerir.
Histogram 8, gerektiğinde uygulanabilir olayları uygulanamaz olaylardan ayırt etmeye yöneliktir.
Bölge Oluşturma
Bölgeleri aşağıdaki gibi hazırlayınız:
1. Histogram 1 – Tüm CD45
+
lökositlerini içeren ve trombositleri, kırmızı kan hücreleri birikintilerini ve agregatları
ortadan kaldıran doğrusal bir A Bölgesi oluşturun.
2. Histogram 1 – Lenfositler üzerinde şekilsiz bir E Bölgesi oluşturun (parlak CD45, düşük yan saçılma).
