B60231–AE
114 of 128
Reaģenti un paraugi
Tilpums
1X NH
4
Cl Lysing Solution
2 ml
Jāveic virpuļveida maisīšana — 10 minūtes jāinkubē istabas temperatūrā. Sargājiet no gaismas
Stem-Count Fluorospheres
100 µl
MANUĀLĀ ATSIJĀŠANAS UN ANALĪZES METODE
Protokola iestatīšana
Plūsmas citometram ir jābūt aprīkotam tā, lai noteiktu uz priekšu vērsto izkliedi, sānu izkliedi un četrus fluorescences
kanālus. FL3 kanālam (Stem-Count vai Flow-Count fluorosfēru uzraudzīšanai) izmantojiet 620 nm frekvenču joslas filtru.
FL4 kanālam (7-AAD dzīvotspējas krāsvielu uzraudzīšanai) izmantojiet 675 nm garu caurlaides filtru.
PIEZĪME.
Stem-Trol kontroles šūnām ir jāievēro tāda pati atsijāšanas shēma un 8 histogrammu sērija,
kā norādīts parauga analīzei. Tā kā Stem-Trol kontroles šūnām ir lieluma raksturlielumi, kas
ir tuvu CD45 un CD34 antigēniem un izpaužas to blīvumā, kas aptuveni atbilst normālām
nenobriedušām hematopoētiskām šūnām, nav nepieciešams mainīt reģiona robežas gar uz
priekšu vērstu izkliedi un 1. fluorescences un 2. Fluorescences kanāliem. Tā kā Stem-Trol
kontroles šūnu sānu izkliedes raksturlielumi ir unikāli, jūs varat pielāgot reģiona robežas gar
sānu izkliedi. A, B, C un D reģioni (skatīt sadaļu Reģiona izveide reģiona noteikšanai) ir
jāmaina, lai iekļautu Stem-Trol kontroles šūnu raksturīpašību klasteri.
Histogrammas izveide
Izveidojiet histogrammas šādi:
1. Izveidojiet 1. histogrammu kā FL1 CD45-FITC pret sānu izkliedi.
2. Izveidojiet 2. histogrammu kā FL2 CD34-PE pret sānu izkliedi.
3. Izveidojiet 3. histogrammu kā FL1 CD45-FITC pret sānu izkliedi.
4. Izveidojiet 4. histogrammu kā uz priekšu vērstu izkliedi pret sānu izkliedi.
5. Izveidojiet 5. histogrammu kā FL1 CD45-FITC pret FL2 CD34-PE.
6. Izveidojiet 6. histogrammu kā uz priekšu vērstu izkliedi pret sānu izkliedi.
7. Izveidojiet 7. histogrammu kā laiku pret FL3 Stem-Count vai Flow-Count fluorosfērām.
8. Izveidojiet 8. histogrammu kā FL4 7-AAD pret sānu izkliedi.
1.–4. histogramma ir paredzēta, lai raksturotu CD34
+
HPC — procesu, kurš var aizkavēties līdz analīzes darbībai. Šīs pirmās
četras histogrammas ir iestatītas saskaņā ar ISHAGE vadlīnijām par CD34
+
šūnu noteikšanu ar plūsmas citometriju (2, 3).
5.–7. histogramma ir paredzēta, lai uzraudzītu parametrus, kas ir svarīgi iegūšanas darbības laikā. To skatā ietilpst uz
priekšu vērstās izkliedes diskriminators, savācamo CD45
+
notikumu skaits un pareizā fluorosfēru singletu uzkrāšana.
8.
histogramma ir paredzēta, lai nepieciešamības gadījumā nošķirtu un analizētu dzīvotspējīgus notikumus no
dzīvotnespējīgiem notikumiem.
Reģiona izveide
Reģioni ir jāizveido tālāk aprakstītajā veidā.
1. 1. histogramma — izveidojiet taisnvirziena apgabalu A, iekļaujot visus CD45
+
leikocītus un izslēdzot trombocītus,
sarkano asinsķermenīšu atliekas un agregātus.
2. 1. histogramma — izveidojiet amorfu E reģionu limfocītiem (spilgts CD45, zema sānu izkliede).
3. 2. histogramma — izveidojiet taisnvirziena B reģionu 2. histogrammā, lai iekļautu visus CD34
+
notikumus ar zemu
līdz vidēju izkliedi. Iestatiet 2. histogrammas apturēšanas skaitu par 75 000 notikumiem (CD45
+
notikumi).
4. 3. histogramma — izveidojiet 3. histogrammā amorfu apgabalu C, iekļaujot visus klasterizētos CD45
dim
notikumus.
5. 4. histogramma — 4. histogrammā izveidojiet amorfu D reģionu, iekļaujot tajā visus klasterizētos notikumus ar vidēju
sānu izkliedi un vidēju līdz augstu uz priekšu vērstu izkliedi.
6. 5. histogramma — 5. histogrammā izveidojiet kvadrastatisku reģionu, lai pārbaudītu CD45 izteiksmes apakšējo robežu
CD34
+
notikumiem.
7. 5. histogramma — 5. histogrammā izveidojiet amorfu H reģionu, aptverot visas Stem-Count vai Flow-Count
fluorosfēras, tostarp dubletus. H reģionam jāatrodas 5. histogrammas augšējā labajā stūrī.
