B60231–AE
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Creazione delle Regioni
Creare le regioni come segue:
1. Istogramma 1. Creare una regione rettilinea A in modo da includere tutti i leucociti CD45
+
ed eliminare le
piastrine, i residui di eritrociti e gli aggregati.
2. Istogramma 1. Creare una regione amorfa E nei linfociti (CD45 brillante, scatter laterale basso).
3. Istogramma 2. Creare una regione rettilinea B nell’istogramma 2 in modo da includere tutti gli eventi CD34
+
con scatter laterale da basso a intermedio. Impostare un conteggio di arresto di 75.000 eventi (eventi CD45
+
)
nell’istogramma 2.
4. Istogramma 3. Creare una regione amorfa C sull’istogramma 3 in modo da includere tutti gli eventi CD45
dim
raggruppati.
5. Istogramma 4. Creare una regione amorfa D sull’istogramma 4 in modo da includere tutti gli eventi raggruppati
con scatter laterale intermedio e scatter frontale da intermedio a elevato.
6. Istogramma 5.
Creare una regione Quadstat I sull’istogramma 5 per verificare il limite inferiore
dell’espressione CD45 negli eventi CD34
+
.
7. Istogramma 5.
Creare una regione amorfa H sull’istogramma 5 per circondare Stem-Count o
Flow-Count Fluorospheres, inclusi i dipoli.
La regione H deve trovarsi nell’angolo in alto a destra
dell’istogramma 5.
NOTA:
Accertarsi che la regione H sia disegnata come regione AMORPHOUS (Amorfa).
8. Istogramma 6. Copiare la regione D dall’istogramma 4 come regione F nell’istogramma 6.
9. Istogramma 7. Creare una regione rettilinea G sull’istogramma 7 in modo da includere solo tutti i singoletti
di Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres. Per calcolare automaticamente i numeri assoluti di HPC di
CD34
+
, è possibile etichettare la regione G come “CAL” (per maggiori dettagli, fare riferimento al manuale
dello strumento).
10.Istogramma 8. Creare una regione rettilinea J sull’istogramma 8 per separare i leucociti vitali (eventi negativi
7-AAD) dagli eventi non vitali (soprattutto Stem-Trol Control Cells positivo per colorazione 7-AAD).
Creazione delle Finestre di Analisi
Creare i gate come segue:
1. Istogramma 1. Assegnare “H” all’istogramma 1 per visualizzare tutti gli eventi ad eccezione di Stem-Count o
Flow-Count Fluorospheres. Fare riferimento al manuale dello strumento per la creazione di “not gates ”.
2. Istogramma 2. Assegnare “A” all’istogramma 2 per visualizzare tutti gli eventi CD45
+
.
3. Istogramma 3. Assegnare “A” e “B” (AB) all’istogramma 3 per visualizzare tutti gli eventi CD45
+
CD34
+
.
4. Istogramma 4. Assegnare “A”, “B” e “C” (ABC) all’istogramma 4 per visualizzare tutti gli eventi CD45
+
CD34
+
raggruppati con scatter laterale da basso a intermedio ed espressione di colorazione CD45 bassa. Gli eventi
della regione ABCD sono reali HPC di CD34
+
.
5. Istogramma 5. Senza gate per visualizzare tutti gli eventi.
6. Istogramma 6. Assegnare “E” per visualizzare i linfociti come controllo visivo sul discriminatore.
7. Istogramma 7. Assegnare “H” all’istogramma 7 per visualizzare Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres,
inclusi i dipoli.
8. Istogramma 8. Assegnare “A” all’istogramma 8 per visualizzare gli eventi CD45
+
.
Configurazione del citometro a flusso
1. Verificare che il citometro a flusso sia correttamente allineato e standardizzato per lo scatter di luce e l’intensità
della fluorescenza, secondo le linee guida del produttore e del laboratorio. Verificare che la compensazione
del colore sia impostata per il funzionamento standard. Per maggiori istruzioni, fare riferimento al manuale
dello strumento.
2. Agitare le provette test per 5 secondi.
3. Effettuare l’acquisizione dei dati nel citometro a flusso. È necessario analizzare almeno 75.000 eventi CD45
+
.
4. Regolare il discriminatore e le regioni analizzando la provetta TROL 45/34/7-AAD.
Esempio di Analisi
Gli istogrammi riportati nell’APPENDICE vengono visualizzati in ordine ascendente come indicato nel protocollo.
