B60231–AE
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7. Histograma 7 – Asignar la Región H amorfa en el Histograma 7 con el fin de visualizar todas las Stem-Count
o Flow-Count Fluorospheres, incluidos los dobletes.
8. Histograma 8 – Asignar la Región “A” al Histograma 8 con el fin de visualizar todos los eventos CD45
+
.
Ajuste del citómetro de flujo
1. Compruebe que el citómetro de flujo esté correctamente alineado y calibrado para medir la intensidad de la
dispersión de la luz y la fluorescencia conforme a las instrucciones del fabricante y del laboratorio. Compruebe
que la compensación de color esté configurada para una operación estándar. Para obtener información
complementaria, consulte el manual del instrumento.
2. Mezcle al Vórtex los tubos de muestra durante 5 segundos.
3. Realizar la adquisición de datos en el citómetro de flujo. Debe analizarse un mínimo de 75 000 eventos
CD45
+
.
4. Ajuste el discriminador y las regiones analizando el tubo de muestra TROL 45/34/7-AAD.
Ejemplo de Análisis
Los histogramas que se muestran en el ANEXO se entregan en un orden numérico ascendente, tal como se indica
en el protocolo.
Cálculo de las Stem-Trol Control Cells CD34
+
Mediante el uso de los resultados del citómetro de flujo ajustados de manera automática con la concentración
ensayada (assayed concentration) de Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres obtenidas mediante el uso del
programa informático System II Software (Versión 3.0) y el citómetro de flujo COULTER EPICS XL/XLMCL.
Con el fin de obtener los recuentos absolutos calculados de forma automática por la citometría de flujo COULTER
EPICS XL / XL-MCL, se debe introducir la concentración ensayada correcta de Stem-Count o Flow-Count
Fluorospheres antes de la adquisición de la muestra.
Introduzca «CAL» como el nombre de los singletes de las Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres de la Región
G, entre, por ejemplo, el valor 1000 en el cuadro CAL FACTOR (FACTOR CAL) en la pantalla de diálogo
STATISTICS (ESTADÍSTICAS) que aparece en la SET-UP SCREEN (PANTALLA DE CONFIGURACIÓN) del
menú PROTOCOL (PROTOCOLO).
Introducción del Factor CAL para las Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres:
1. En la pantalla de Acquisition Run (Ejecutar adquisición), seleccione Setup Screen (Pantalla de configuración)
>> Protocol (Protocolo).
2. Estadísticas seleccionadas para el>> FACTOR CAL.
3. Introduzca el número de factor CAL (concentración ensayada) indicado en el frasco de las Stem-Count o
Flow-Count Fluorospheres.
4. Pulse ENTER (INTRO).
5. Seleccione OKAY (OK).
6. Para confirmar, escriba S por sí.
Cuando se obtienen al menos 1000 fluoroesferas singletes, el recuento absoluto para CD34
+
las células de control
Stem-Trol se ajusta de manera automática y se pueden adquirir directamente de los resultados estadísticos
impresos de la Región D.
Tabla (a continuación):
Ejemplo de estadística obtenida con un tubo de muestra TROL 45/34/7-AAD en el System II Software utilizando
la función de FACTOR CAL, donde:
•
La concentración ensayada de Stem-Count Fluorospheres es de 1024.
•
El número total de fluoroesferas acumuladas en la región CAL durante todo el tiempo de adquisición es 5248.
En este ejemplo, todos los recuentos se ajustan en:1024/5248.
Estadística:
Histograma no
normalizado
Listgating: ID de la
región inhabilitada
Ajuste de recuentos
(Cel/µL)
1
A
LEUKS
9798
2
B
CD34 POS
279
