B60231–AE
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IMPORTANTE:
Rischio di ottenere risultati errati in caso di analisi del campione trascorsa 1 ora
dall’aggiunta di Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres. I campioni preparati devono
essere analizzati entro 1 ora dall’aggiunta di Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres.
Riepilogo della preparazione (etichetta della provetta: TROL45/34/7-AAD)
Reagenti e campioni
volume
CD45-FITC / CD34-PE
20 µL
7-AAD - Colorante di vitalità cellulare
20 µL
Sangue intero
100 µL
Stem-Trol Control Cells
20 µL
Agitare - Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Proteggere dalla luce
1X NH
4
Cl Lysing Solution
2 mL
Agitare – Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Proteggere dalla luce
Stem-Count Fluorospheres
100 µL
GATING MANUALE E METODO DI ANALISI
Configurazione del protocollo
Il citometro a flusso deve essere in grado di rilevare Forward Scatter (Scatter frontale), Side Scatter
(Scatter laterale) e quattro canali di fluorescenza.
Per il canale FL3 (per il monitoraggio di Stem-Count o
Flow-Count Fluorospheres) utilizzare un filtro passa banda da 620 nm. Per il canale FL4 (per il monitoraggio del
colorante di vitalità 7-AAD) utilizzare un filtro a passo lungo da 675 nm.
NOTA:
Per Stem-Trol Control Cells, è necessario seguire lo stesso schema di determinazione
del gate e la stessa serie di 8 istogrammi indicati per l’analisi dei campioni. Dal
momento che Stem-Trol Control Cells presenta dimensioni simili a quelle delle cellule
ematopoietiche immature normali e che esprime gli antigeni CD45 e CD34 a densità che
assomigliano a quelli delle cellule ematopoietiche immature normali, non è necessario
modificare i confini delle regioni lungo i canali di Forward Scatter (Scatter frontale),
Fluorescence 1 (Fluorescenza 1) e Fluorescence 2 (Fluorescenza 2). Tuttavia, poiché
le caratteristiche di Side Scatter (Scatter laterale) di Stem-Trol Control Cells sono
univoche, è possibile regolare i confini delle regioni lungo il Side Scatter (Scatter
laterale). Le regioni A, B, C e D (per la definizione della regione, consultare la sezione
Creazione delle regioni) devono essere modificate in modo che includano il cluster delle
caratteristiche di Stem-Trol Control Cells.
Creazione degli Istogrammi:
Creare gli istogrammi come segue:
1. Creare l’istogramma 1 come FL1 CD45-FITC rispetto a scatter laterale.
2. Creare l’istogramma 2 come FL2 CD34-PE rispetto a scatter laterale.
3. Creare l’istogramma 3 come FL1 CD45-FITC rispetto a scatter laterale.
4. Creare l’istogramma 4 come scatter frontale rispetto a scatter laterale.
5. Creare l’istogramma 5 come FL1 CD45-FITC rispetto a FL2 CD34-PE.
6. Creare l’istogramma 6 come scatter frontale rispetto a scatter laterale.
7. Creare l’istogramma 7 come Tempo rispetto a FL3 Stem-Count o Flow-Count Fluorospheres.
8. Creare l’istogramma 8 come FL4 7-AAD rispetto a scatter laterale.
Gli istogrammi da 1 a 4 servono a caratterizzare le HPC di CD34
+
, una procedura che è possibile rimandare fino
al momento dell’analisi. Questi primi quattro istogrammi vengono configurati secondo le linee guida ISHAGE per
la determinazione cellulare di CD34
+
mediante citometria a flusso (2,3).
Gli istogrammi da 5 a 7 servono a monitorare i parametri fondamentali nel corso dell’acquisizione. Questi parametri
includono il discriminatore di Forward Scatter (Scatter frontale), il numero di eventi CD45
+
da raccogliere e il corretto
accumulo di singoletti di fluorosfere.
L’istogramma 8 serve a distinguere e analizzare gli eventi vitali dagli eventi non vitali qualora richiesto.
