B60231–AE
48 of 128
Klargøringsoversigt (etikette på prøverør: TROL45/34/7-AAD)
Reagenser og prøver
Volumen
CD45-FITC / CD34-PE
20 µL
7-AAD levedygtighedsfarvestof
20 µL
Fuldblod
100 µL
Stem-Trol Control Cells
20 µL
Vortex – Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter. Beskyt mod lys
1X NH
4
Cl Lysing Solution
2 mL
Vortex – Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter. Beskyt mod lys
Stem-Count Fluorospheres
100 µL
MANUEL GATING OG ANALYSEMETODE
Indstilling af protokol
Flowcytometret skal være udstyret for at detektere Forward Scatter (forlæns spredning), Side Scatter
(sidelæns spredning) og fire fluorescenskanaler. kaFor FL3-kanalen (til fluorescensovervågning på Stem-Count
Fluorospheres eller Flow-Count Fluorospheres) skal der benyttes et pasfilter med en bånd på 620 nm.
Til
FL4-kanalen (til overvågning af 7-AAD Viability Dye) skal der benyttes et pasfilter med en længde på 675 nm.
BEMÆRK:
Til Stem-Trol Control Cells følges samme gatingskema og serier af 8 histogrammer
som for prøveanalyser. Fordi Stem-Trol Control Cells har størrelsesegenskaber, der
er tæt på og viser CD45- og CD34-antigener med tætheder tæt på normale umodne
hæmatopoietiske celler, er det ikke nødvendigt at ændre regionens grænser langs
kanalerne Forward Scatter (forlæns spredning), fluorescens 1- og fluorescens 2. Fordi
karakteristikaene for Stem-Trol Control Cells Side Scatter (sidelæns spredning) er
unikke, kan der imidlertid være behov for at justere regionens grænser langs Side Scatter
(sidelæns spredning). Region A, B, C og D (se afsnittet Oprettelse af region for definition
af region) skal ændres for at inkludere Stem-Trol Control Cells karakteristiske klynger.
Oprettelse af histogram
Opret histogrammer på følgende måde:
1. Opret histogram 1 som FL1 CD45-FITC vs. Side Scatter (sidelæns spredning).
2. Opret histogram 2 som FL2 CD34-PE vs. Side Scatter (sidelæns spredning).
3. Opret histogram 3 som FL1 CD45-FITC vs. Side Scatter (sidelæns spredning).
4. Opret histogram 4 som Forward Scatter (forlæns spredning) vs. Side Scatter (sidelæns spredning).
5. Opret histogram 5 som FL1 CD45-FITC vs. FL2 CD34-PE.
6. Opret histogram 6 som Forward Scatter (forlæns spredning) vs. Side Scatter (sidelæns spredning).
7. Opret histogram 7 som tid vs. FL3 Stem-Count eller Flow-Count Fluorospheres.
8. Opret histogram 8 som FL4 7-AAD vs. Side Scatter (sidelæns spredning).
Histogram 1 til 4 er beregnet til at karakterisere CD34
+
HPC, en proces, der kan udskydes til analysetrinnet.
Disse første fire histogrammer er indstillet i henhold til ISHAGE-retningslinjerne for CD34
+
-cellefastlæggelse med
Histogram 5 og 7 er beregnet til at overvåge parametre, der er vigtige for det næste trin. Disse omfatter diskriminator
til Forward Scatter (forlæns spredning), antallet af CD45
+
-hændelser, der skal indsamles, og korrekt akkumulering
af enkelte fluorofærer.
Histogram 8 er beregnet til at diskriminere og analysere brugbare hændelser fra ikke-brugbare hændelser, når det
er nødvendigt.
Oprettelse af region
Opret regioner på følgende måde:
1. Histogram 1 – Opret en retlinjet region A for at medtage alle CD45
+
-leukocytter, og fjern blodplader, debris fra
røde blodceller og aggregater.
2. Histogram 1 – Opret en amorphous (amorf) region E på lymfocytterne (lys CD45, lav side scatter (sidelæns
spredning)).
