B60231–AE
55 of 128
Beredningssammanfattning (provrörsetikett: TROL45/34/7-AAD)
Reagenser och prover
Volym
CD45-FITC / CD34-PE
20 µL
7-AAD Viability Dye
20 µL
Helblod
100 µL
Stem-Trol Control Cells
20 µL
Vortexa – inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur. Skydda från ljus
1X NH
4
Cl Lysing Solution
2 mL
Vortexa – inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Skydda från ljus
Stem-Count Fluorospheres
100 µL
MANUELL GATING OCH ANALYSMETOD
Konfigurera protokoll
Flödescytometern måste kunna detektera Forward Scatter (framåtspridning), Side Scatter (sidospridning) och
fyra fluorescenskanaler. Använd ett 620 nm bandpassfilter för kanal FL3 (för övervakning av Stem-Count eller
Flow-Count Fluorospheres). Använd ett 675 nm långpassfilter för kanal FL4 (för 7-AAD-viabilitetsfärgövervakning).
OBS!
Samma gatingschema och serie av 8 histogram som anges för provanalys måste följas
för Stem-Trol Control Cells. Eftersom Stem-Trol Control Cells har storleksegenskaper
som ligger nära normala omogna hematopoetiska celler, och uttrycker CD45- och
CD34-antigener vid densiteter som ligger i närheten av sådana celler, finns inget behov
av att redigera gränserna för regioner längs kanalerna Forward Scatter (framåtspridning),
Fluorescence 1 (fluorescens 1) och Fluorescence 2 (fluorescens 2). Men eftersom
Stem-Trol Control Cells egenskaper för Side Scatter (sidospridning) är unika kan du
justera gränserna för regioner längs sidospridningen. Region A, B, C och D måste
ändras (se avsnittet Skapa regioner för definition av regioner) så att de inkluderar
Stem-Trol Control Cells karaktäristiska kluster.
Skapa Histogram:
Skapa histogram enligt följande:
1. Skapa histogram 1 som FL1 CD45-FITC vs Side Scatter (sidospridning).
2. Skapa histogram 2 som FL2 CD34-PE vs Side Scatter (sidospridning).
3. Skapa histogram 3 som FL1 CD45-FITC vs Side Scatter (sidospridning).
4. Skapa histogram 4 som Forward Scatter (framåtspridning) vs Side Scatter (sidospridning).
5. Skapa histogram 5 som FL1 CD45-FITC vs FL2 CD34-PE.
6. Skapa histogram 6 som Forward Scatter (framåtspridning) vs Side Scatter (sidospridning).
7. Skapa histogram 7 som Time (Tid) vs FL3 Stem-Count eller Flow-Count Fluorospheres.
8. Skapa histogram 8 som FL4 7-AAD vs Side Scatter (sidospridning).
Histogram 1 till 4 är avsedda att karaktärisera CD34
+
HPC, en process som kan senareläggas till analyssteget.
Dessa första fyra histogram är konfigurerade i enlighet med ISHAGE-riktlinjerna för CD34
+
-cellbestämning med
flödescytometri (2,3).
Histogram 5 till 7 är avsedda för övervakning av parametrar som är av vikt under insamlingssteget. De inkluderar
diskriminatorn för Forward Scatter (framåtspridning), antalet CD45
+
-händelser som ska samlas in och korrekt
ackumulering av singletter av fluorosfärer.
Histogram 8 är avsett att skilja mellan och analysera viabla/icke-viabla händelser vid behov.
Skapa Region
Skapa regioner enligt följande:
1. Histogram 1 – skapa en rätlinjig region A som ska inkludera alla CD45
+
leukocyter och avlägsna trombocyter,
rester av röda blodkroppar och aggregat.
2. Histogram 1 – skapa en amorf region E på lymfocyterna (ljusstarka CD45, låg side scatter (sidospridning)).
