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Software do sistema stemCXP, SOMENTE para análise automatizada de células de controle Stem-Trol nos
citômetros de fluxo FC 500 equipados com o software CXP.
PROCEDIMENTO
Para a análise automática, consulte o stemCXP System Guide (Guia do sistema stemCXP) fornecido com o
software do sistema stemCXP para obter instruções completas.
Para a análise manual, consulte o folheto informativo dos reagentes Stem-Kit e o procedimento a seguir.
OBSERVAÇÃO: Para padronizar a análise, ao receber novos reagentes Stem-Kit, e em intervalos diários
posteriores, execute uma verificação do processo através da coloração das células
de controle Stem-Trol com uma amostra de sangue periférico normal de um doador
saudável. Além disso, como as células de controle Stem-Trol são células estabilizadas
(isto é, células não viáveis), a coloração do corante de viabilidade 7-AAD pode ser
verificada visualmente nas células de controle Stem-Trol (consulte o título: Criação
dos histogramas).
Garanta que o citômetro de fluxo está devidamente alinhado e padronizado para a intensidade de fluorescência de
acordo com as orientações do fabricante e do laboratório. Certifique-se de que as configurações de compensação
de fluorescência estão devidamente ajustadas de acordo com as orientações do fabricante e do laboratório.
Coloque o reagente de controle e os anticorpos à temperatura ambiente.
Para cada experimento, rotule um tubo: TROL 45/34/7-AAD.
1. Pipete 20 µL de CD45-FITC/CD34-PE para dentro do tubo.
2. Pipete 20 µL do corante de viabilidade 7-AAD para dentro do tubo.
IMPORTANTE:
Há o risco de lise incompleta se o espécime de sangue permanecer na parte superior ou
lateral do tubo de teste. Tenha cuidado durante a pipetagem para evitar que o sangue
toque o a parte superior ou a lateral do tubo de teste. Limpe o tubo com um swab, se
necessário, para remover todos os vestígios de amostras de sangue da parte superior
ou lateral do tubo de teste.
3. Na parte inferior do tubo, pipete exatamente 100 µL de uma amostra de sangue total normal bem misturada
usando uma pipeta de deslocamento positivo ou de repetição calibrada.
4. Prepare e adicione Stem-Trol:
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Agite as células de controle Stem-Trol em vórtex por 5 segundos.
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Pipete exatamente 20 µL de células de controle Stem-Trol para dentro do tubo.
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Agite os tubos em vórtex por 5 segundos.
5. Incube à temperatura ambiente (18–25°C) durante 20 minutos, ao abrigo da luz.
6. Adicione 2 mL de solução de lise com NH
4
Cl 1x preparada no tubo e imediatamente agite em vórtex por 5
segundos.
Para obter detalhes sobre como preparar a solução de lise, consulte o folheto informativo dos reagentes
Stem-Kit.
7. Incube à temperatura ambiente durante 10 minutos, ao abrigo da luz.
8. Armazene os tubos em um rack no gelo (2–8°C) e protegidos da luz.
IMPORTANTE:
Há risco de resultados errados se bolhas de ar forem pipetadas. A mistura excessiva
das fluoroesferas Stem-Count ou Flow-Count pode criar bolhas de ar. Não misture
excessivamente as fluoroesferas Stem-Count ou Flow-Count, e não pipete bolhas de ar
para os tubos de amostra.
9. Misture suavemente as fluoroesferas Stem-Count ou Flow-Count invertendo o frasco 3 a 5 vezes antes do
uso. Evite a mistura excessiva para minimizar a formação de bolhas de ar.
10.Antes da aquisição, pipete 100 µL de fluoroesferas Stem-Count ou Flow-Count para dentro do tubo.
11. Agite em vórtex por 5 segundos imediatamente após cada adição. Armazene a 2–8°C. Agite novamente em
vórtex imediatamente antes da aquisição de citometria de fluxo.
