B60231–AE
63 of 128
ΣΗΜΕΙΩΣΗ:
Για το Stem-Trol Control Cells, πρέπει να χρησιμοποιείται το ίδιο σχήμα οριοθέτησης
και η ίδια σειρά 8 ιστογραμμάτων όπως ορίζονται για την ανάλυση δειγμάτων. Καθώς
τα Stem-Trol Control Cells διαθέτουν χαρακτηριστικά μεγέθους που προσεγγίζουν τα
φυσιολογικά πρώιμα αιμοποιητικά κύτταρα, και καθώς εκφράζουν αντιγόνα CD45 και
CD34 σε πυκνότητες που πλησιάζουν τα φυσιολογικά πρώιμα αιμοποιητικά κύτταρα,
δεν είναι αναγκαία η τροποποίηση των ορίων περιοχής για τα κανάλια Forward Scatter
(Πρόσθια σκέδαση), Fluorescence 1 (Φθορισμός 1) και Fluorescence 2 (Φθορισμός 2).
Ωστόσο, καθότι τα χαρακτηριστικά Side Scatter (Πλάγια σκέδαση) των Stem-Trol Control
Cells είναι μοναδικά, μπορείτε να προσαρμόσετε τα όρια της περιοχής ως προς το Side
Scatter (Πλάγια σκέδαση). Οι περιοχές A, B, C και D (βλ. ενότητα Δημιουργία περιοχής,
για τον ορισμό μιας περιοχής) πρέπει να τροποποιηθούν, ώστε να συμπεριληφθεί η
ομάδα χαρακτηριστικών των Stem-Trol Control Cells.
Δημιουργία Ιστογράμματος:
Δημιουργήστε ιστογράμματα ως ακολούθως:
1. Δημιουργήστε Ιστόγραμμα 1 ως FL1 CD45-FITC vs Side Scatter (FL1 CD45-FITC έναντι πλάγιας σκέδασης).
2. Δημιουργήστε Ιστόγραμμα 2 ως FL2 CD34-PE vs Side Scatter (FL2 CD34-PE έναντι πλάγιας σκέδασης).
3. Δημιουργήστε Ιστόγραμμα 3 ως FL1 CD45-FITC vs Side Scatter (FL1 CD45-FITC έναντι πλάγιας σκέδασης).
4. Δημιουργήστε Ιστόγραμμα 4 ως Forward Scatter vs Side Scatter (Πρόσθια σκέδαση έναντι πλάγιας
σκέδασης).
5. Δημιουργήστε Ιστόγραμμα 5 ως FL1 CD45-FITC vs FL2 CD34-PE (FL1 CD45-FITC έναντι FL2 CD34-PE).
6. Δημιουργήστε Ιστόγραμμα 6 ως Forward Scatter vs Side Scatter (Πρόσθια σκέδαση έναντι πλάγιας
σκέδασης).
7. Δημιουργήστε Ιστόγραμμα 7 ως Time vs FL3 Stem-Count or Flow-Count Fluorospheres (Χρόνος έναντι FL3
Stem-Count ή Flow-Count Fluorospheres).
8. Δημιουργήστε Ιστόγραμμα 8 ως FL4 7-AAD vs Side Scatter (FL4 7-AAD έναντι πλάγιας σκέδασης).
Τα Ιστογράμματα 1 έως 4 προορίζονται για τον χαρακτηρισμό των CD34
+
HPC, μια διαδικασία που μπορεί να
καθυστερήσει μέχρι το βήμα της ανάλυσης. Αυτά τα τέσσερα πρώτα ιστογράμματα διαμορφώνονται σύμφωνα με
τις κατευθυντήριες οδηγίες της ISHAGE για τον προσδιορισμό των κυττάρων CD34
+
με κυτταρομετρία ροής (2,3).
Τα Ιστογράμματα 5 έως 7 προορίζονται για την παρακολούθηση των παραμέτρων που είναι σημαντικές κατά τη
διάρκεια του βήματος λήψης. Σε αυτές περιλαμβάνονται ο διαχωριστής Forward Scatter (Πρόσθια σκέδαση), ο
αριθμός των προς συλλογή συμβάντων CD45
+
και η σωστή συσσώρευση μονών σφαιριδίων φθορισμού.
Το Ιστόγραμμα 8 προορίζεται για τη διάκριση των βιώσιμων συμβάντων από τα μη βιώσιμα συμβάντα και την
ανάλυσή τους, όταν απαιτείται.
Δημιουργία Περιοχής
Δημιουργήστε τις περιοχές ως ακολούθως:
1. Ιστόγραμμα 1 – Δημιουργήστε μια ορθογώνια περιοχή A για να συμπεριλάβετε όλα τα λευκοκύτταρα CD45
+
και να αποκλείσετε τα αιμοπετάλια, τα υπολείμματα ερυθρών αιμοσφαιρίων και τα συσσωματώματα.
2. Ιστόγραμμα 1 – Δημιουργήστε μια άμορφη περιοχή E επί των λεμφοκυττάρων (φωτεινό CD45, χαμηλή πλάγια
σκέδαση).
3. Ιστόγραμμα 2 – Δημιουργήστε μια ορθογώνια περιοχή B στο Ιστόγραμμα 2 για να συμπεριλάβετε όλα τα
συμβάντα CD34
+
με χαμηλή έως μέτρια πλάγια σκέδαση. Ορίστε ως αριθμό διακοπής της καταμέτρησης τα
75.000 συμβάντα (συμβάντα CD45
+
) στο Ιστόγραμμα 2.
4. Ιστόγραμμα 3 – Δημιουργήστε μια άμορφη περιοχή C στο Ιστόγραμμα 3 για να συμπεριλάβετε όλα τα
ομαδοποιημένα συμβάντα CD45
dim
.
5. Ιστόγραμμα 4 – Δημιουργήστε μια άμορφη περιοχή D στο Ιστόγραμμα 4 για να συμπεριλάβετε όλα τα
ομαδοποιημένα συμβάντα με μέτρια πλάγια σκέδαση και μέτρια έως υψηλή πρόσθια σκέδαση.
6. Ιστόγραμμα 5 – Δημιουργήστε μια περιοχή τεταρτημόριου I στο Ιστόγραμμα 5 για επαλήθευση του κατώτερου
ορίου της έκφρασης του CD45 σε συμβάντα CD34
+
.
7. Ιστόγραμμα 5 – Δημιουργήστε μια άμορφη περιοχή H στο Ιστόγραμμα 5 για να περιγράψετε όλα τα
Stem-Count ή Flow-Count Fluorospheres, συμπεριλαμβανομένων των διπλών. Η περιοχή H θα πρέπει να
βρίσκεται στην άνω δεξιά γωνία του Ιστογράμματος 5.
