B60231–AE
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10.Avant l’acquisition, pipeter 100 µL de Stem-Count ou Flow-Count Fluorospheres dans le tube d’échantillon.
11. Agiter au vortex pendant 5 secondes immédiatement après chaque addition. Conserver à une température
comprise entre 2–8 °C. Agiter à nouveau au vortex immédiatement avant l’acquisition par cytométrie en flux.
IMPORTANT:
Risque de résultats erronés si l’échantillon est analysé plus d’une heure après l’addition
des Stem-Count ou Flow-Count Fluorospheres. Les échantillons préparés doivent être
analysés dans l’heure qui suit l’addition des Stem-Count ou Flow-Count Fluorospheres.
Résumé de la préparation (étiquette du tube d’échantillon :TROL45/34/7-AAD)
Réactifs et échantillons
Volume
CD45-FITC / CD34-PE
20 µL
Colorant viabilité 7-aminoactinomycine
20 µL
Sang total
100 µL
Stem-Trol Control Cells
20 µL
Agiter au vortex – Laisser incuber à température ambiante pendant 20 minutes.
Conserver à l’abri de la lumière
1X NH
4
Cl Lysing Solution
2 mL
Agiter au vortex – Laisser incuber à température ambiante pendant 10 minutes.
Conserver à l’abri de la lumière
Stem-Count Fluorospheres
100 µL
CONFIGURATION MANUELLE ET MÉTHODE D’ANALYSE
Configuration du protocole
Le cytomètre en flux doit être équipé pour détecter le Forward Scatter (diffusion avant), le Side Scatter (diffusion
latérale) et les quatre canaux de fluorescence. Pour le canal FL3 (pour la surveillance des Stem-Count ou
Flow-Count Fluorospheres) utiliser un filtre passe-bande de 620 nm. Pour le canal FL4 (pour la surveillance du
marqueur de viabilité 7-AAD Viability Dye) utiliser un filtre passe-long de 675 nm.
REMARQUE:
Le même schéma de configuration avec des séries de 8 histogrammes doit être respecté
pour les Stem-Trol Control Cells, tel qu’indiqué pour l’analyse d’échantillon. Comme les
Stem-Trol Control Cells ont une taille proche et expriment les antigènes CD45 et CD34
à des densités proches de celles des cellules hématopoïétique immatures normales,
il n’est pas nécessaire de modifier les limites de région le long du Forward Scatter
(diffusion avant) et des canaux Fluorescence 1 et Fluorescence 2. Cependant, comme
les caractéristiques de Side Scatter (diffusion latérale) des Stem-Trol Control Cells sont
uniques, il est possible d’ajuster les limites de région le long du Side Scatter (diffusion
latérale). Les régions A, B, C et D (cf. la rubrique Création de région pour la définition
des régions) doivent être modifiées pour inclure les caractéristiques du groupe des
Stem-Trol Control Cells.
Création des Histogrammes:
Créer les histogrammes de la manière suivante :
1. Créer l’Histogramme 1 en plaçant le FL1 CD45-FITC vs le Side Scatter (diffusion latérale).
2. Créer l’Histogramme 2 en plaçant le FL2 CD34-PE vs le Side Scatter (diffusion latérale).
3. Créer l’Histogramme 3 en plaçant le FL1 CD45-FITC vs le Side Scatter (diffusion latérale).
4. Créer l’Histogramme 4 en plaçant le Forward Scatter (diffusion avant) vs le Side Scatter (diffusion latérale).
5. Créer l’Histogramme 5 en plaçant le FL1 CD45-FITC vs le FL2 CD34-PE.
6. Créer l’Histogramme 6 en plaçant le Forward Scatter (diffusion avant) vs le Side Scatter (diffusion latérale).
7. Créer l’Histogramme 7 en plaçant Time vs les FL3 Stem-Count ou Flow-Count Fluorospheres.
8. Créer l’Histogramme 8 en plaçant le FL4 7-AAD vs le Side Scatter (diffusion latérale).
Les Histogrammes 1 à 4 sont destinés à caractériser CD34
+
HPC, un processus qui peut être retardé jusqu’à l’étape
de l’analyse. Ces quatre premiers histogrammes sont configurés conformément aux recommandations ISHAGE
pour CD34
+
détermination cellulaire de la cytométrie en flux (2,3).
