B60231–AE
56 of 128
3. Histogram 2 – skapa en rätlinjig region B på histogram 2 som ska inkludera alla CD34
+
-händelser med låg
till intermediär Side Scatter (sidospridning). Ställ in ett stoppantal på 75 000 händelser (CD45
+
-händelser) i
histogram 2.
4. Histogram 3 – skapa en amorf region C på histogram 3 som ska inkludera alla CD45
dim
-klusterhändelser.
5. Histogram 4 – skapa en amorf region D på histogram 4 som ska inkludera alla klusterhändelser med medelhög
side scatter (sidospridning) och medelhög till hög forward scatter (framåtspridning).
6. Histogram 5 – skapa en Quadstat-region I på histogram 5 för att verifiera den nedre gränsen för CD45-uttryck
på CD34
+
-händelser.
7. Histogram 5 – skapa en amorf region H på histogram 5 som ska omge alla Stem-Count eller Flow-Count
Fluorospheres, inklusive dubbletter. Region H ska vara placerad i det övre högra hörnet av histogram 5.
OBS!
Säkerställ att region H ritas som en AMORPHOUS (amorf) region.
8. Histogram 6 – kopiera region D från histogram 4 som region F i histogram 6.
9. Histogram 7 – skapa en rätlinjig region G på histogram 7 som ska inkludera enbart singletter av Stem-Count
eller Flow-Count Fluorospheres. Region G kan etiketteras ”CAL” (kalibrering) för att möjliggöra automatisk
beräkning av absoluta antal CD34
+
HPC (mer information finns i instrumentets bruksanvisning).
10.Histogram 8 – skapa en rätlinjig region J på histogram 8 som ska separera viabla leukocyter (7-AAD-negativa
händelser) från icke viabla händelser (huvudsakligen Stem-Trol Control Cells positiva för 7-AAD-färgning).
Skapa Gate
Skapa gates enligt följande:
1. Histogram 1 – tilldela ”H” till histogram 1 för visning av alla händelser med undantag av alla Stem-Count eller
Flow-Count Fluorospheres. Se instrumentets bruksanvisning för anvisningar om att skapa ”not gates”.
2. Histogram 2 – tilldela ”A” till histogram 2 för visning av alla CD45
+
-händelser.
3. Histogram 3 – tilldela ”A” och ”B” (AB) till histogram 3 för visning av alla CD45
+
CD34
+
-händelser.
4. Histogram 4 – tilldela ”A” och ”B” och ”C” (ABC) till histogram 4 för visning av alla CD45
+
CD34
+
-klusterhändelser med låg till medelhög side scatter (sidospridning) och lågt CD45-färgningsuttryck.
Händelser från region ABCD är verkliga CD34
+
HPC.
5. Histogram 5 – ogated för visning av alla händelser.
6. Histogram 6 – tilldela ”E” för visning av lymfocyter som en visuell kontroll för diskriminatorn.
7. Histogram 7 – tilldela ”H” till histogram 7 för visning av alla Stem-Count eller Flow-Count Fluorospheres,
inklusive dubbletter.
8. Histogram 8 – tilldela ”A” till histogram 8 för visning av CD45
+
-händelser.
Inställning av flödescytometer
1. Kontrollera
att
flödescytometern
är
korrekt
inställd
och
standardiserad
för
ljusspridning
och
fluorescensintensitet enligt tillverkarens och laboratoriets riktlinjer.
Kontrollera att färgkompensation har
ställts in för standardanvändning. Ytterligare instruktioner finns i instrumentets bruksanvisning.
2. Vortexa provrören i 5 sekunder.
3. Utför datainsamling på flödescytometern. Minst 75 000 CD45
+
-händelser måste analyseras.
4. Justera diskriminatorn och regionerna genom att analysera provröret TROL 45/34/7-AAD.
Analysexempel
Histogrammen i BILAGA visas i stigande nummerordning så som de visas i protokollet.
Beräkning av CD34
+
Stem-Trol Control Cells
Använd flödescytometriska resultat automatiskt justerade med Stem-Count eller Flow-Count Fluorospheres
analyserade koncentration som erhållits med System II-programvara (version 3.0) och en COULTER EPICS
XL/XLMCL flödescytometer.
För att kunna erhålla automatiskt beräknade bestämningar av absoluta antal på COULTER EPICS XL/XL-MCL
flödescytometrar måste rätt analyserad koncentration för Stem-Count eller Flow-Count Fluorospheres anges före
provinsamling.
