Beckman Coulter IM3632 Page 1 Manual Download

Page: 1 / 128

B60231–AE

Stem-Trol Control Cells

IM3632

TABLE OF CONTENTS

English . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Français (FR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Deutsch (DE)

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Italiano (IT)

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Español (ES) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Português Portugal (PT-PT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Dansk (DA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Svenska (SV) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Ελληνικά (EL) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Magyar (HU) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Polski (PL) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Čeština (CZ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Türkçe (TR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Русский (RU) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Română (RO) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

104

Latviešu (LV) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

111

Português Brasil (PT-BR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

118

APPENDIX

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

125

REFERENCES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

127

Summary of Contents for IM3632

Page 1: ...6 Italiano IT 23 Español ES 30 Português Portugal PT PT 38 Dansk DA 45 Svenska SV 52 Ελληνικά EL 59 Magyar HU 67 Polski PL 74 Čeština CZ 82 Türkçe TR 89 Русский RU 96 Română RO 104 Latviešu LV 111 Português Brasil PT BR 118 APPENDIX 125 REFERENCES 127 2019 Beckman Coulter Inc All rights reserved ...

Page 2: ...e of Stem Trol Control Cells spiked into normal fresh whole blood is first stained with the monoclonal antibody reagents and 7 AAD Viability Dye and then lysed to remove erythrocytes Stem Count or Flow Count Fluorospheres are added for the direct determination of absolute counts Flow cytometric analysis of the stained and lysed preparation determines the absolute count of the targeted cells Expect...

Page 3: ...scatter or fluorescence properties may indicate product deterioration Instrument standardization sample preparation technique and antibody performance should also be investigated Any change in the physical appearance of Stem Trol Control Cells normal appearance is a colorless liquid or any major variation 15 change in absolute count in values obtained from replicated tests by flow cytometry analys...

Page 4: ...ol Control Cells for 5 seconds Accurately pipet 20 µL of Stem Trol Control Cells into the tube Vortex tubes for 5 seconds 5 Incubate at room temperature 18 25 C for 20 minutes protected from light 6 Add 2 mL of prepared 1X NH4Cl Lysing Solution into tube and vortex immediately for 5 seconds For details on preparing the Lysing Solution refer to the Stem Kit Reagents package insert 7 Incubate at roo...

Page 5: ...tter vs Side Scatter 5 Create Histogram 5 as FL1 CD45 FITC vs FL2 CD34 PE 6 Create Histogram 6 as Forward Scatter vs Side Scatter 7 Create Histogram 7 as Time vs FL3 Stem Count or Flow Count Fluorospheres 8 Create Histogram 8 as FL4 7 AAD vs Side Scatter Histograms 1 to 4 are intended to characterize CD34 HPC a process that may be delayed until the analysis step These first four histograms are set...

Page 6: ...nt or Flow Count Fluorospheres including doublets 8 Histogram 8 Assign A to histogram 8 to display CD45 events Flow Cytometer Setting 1 Ensure that the flow cytometer is properly aligned and standardized for light scatter and fluorescence intensity according to the manufacturer s and laboratory guidelines Verify that color compensation is set for standard operation Refer to the instrument s manual...

Page 7: ...t Fluorospheres singlets by the volume of Stem Trol Control Cells added to the test tube Example 100 µL Stem Count Fluorospheres are added to 20 µL of Stem Trol Control Cells N 100 20 5 Normalized Stem Trol Control Cells absolute count 248 x 5 1 240 cells µL 3 Verify the Stem Trol Control Cells absolute count obtained by comparing it to the Stem Trol Control Cells Assayed Concentration cells µL st...

Page 8: ...er product and service marks mentioned herein are trademarks or registered trademarks of Beckman Coulter Inc in the United States and other countries ADDITIONAL INFORMATION www beckmancoulter com Symbols Key Glossary of Symbols is available at beckman com techdocs document number B60062 ...

Page 9: ...s et stabilisées pour exprimer les épitopes de classe III CD34 2 et l antigène leucocytaire commun CD45 à des densités proches de celles des cellules hématopoïétiques humaines immatures normales Un mélange de Stem Trol Control Cells inoculé dans du sang frais total normal est d abord coloré par les réactifs d anticorps monoclonal et le marqueur de viabilité 7 AAD Viability Dye puis lysé pour retir...

Page 10: ...t de 30 jours Les flacons ouverts doivent être hermétiquement rebouchés et conservés à une température comprise entre 2 8 C après utilisation Ne pas les congeler Amener les Stem Trol Control Cells à la température ambiante 18 25 C avant utilisation IMPORTANT Risque de résultats erronés en cas de fuite des Stem Trol Control Cells Une fois ouvert le flacon de Stem Trol Control Cells doit être rangé ...

Page 11: ...RTANT Risque de lyse incomplète en cas de résidus d échantillon de sang sur la partie supérieure ou latérale du tube à essai Pipeter soigneusement pour éviter que le sang n entre en contact avec la partie supérieure ou latérale du tube à essai Nettoyer le tube d échantillon avec un coton tige si nécessaire afin d enlever toute trace de l échantillon de sang sur la partie supérieure ou latérale du ...

Page 12: ...cté pour les Stem Trol Control Cells tel qu indiqué pour l analyse d échantillon Comme les Stem Trol Control Cells ont une taille proche et expriment les antigènes CD45 et CD34 à des densités proches de celles des cellules hématopoïétique immatures normales il n est pas nécessaire de modifier les limites de région le long du Forward Scatter diffusion avant et des canaux Fluorescence 1 et Fluoresce...

Page 13: ...Histogramme 5 REMARQUE s assurer que la région H est dessinée comme une région AMORPHOUS AMORPHE 8 Histogramme 6 Copier la région D de l Histogramme 4 en tant que région F de l Histogramme 6 9 Histogramme 7 Créer une région rectilinéaire G sur l Histogramme 7 pour englober uniquement les singulets Stem Count ou Flow Count Fluorospheres La région G peut être étiquetée CAL pour permettre le calcul a...

Page 14: ...s Stem Count ou Flow Count Fluorospheres de la région G puis saisir la valeur par exemple 1 000 dans la zone CAL FACTOR facteur cal sur l écran de dialogue STATISTICS statistiques du menu SET UP SCREEN PROTOCOL écran de configuration du protocole Entrer le CAL Factor facteur CAL pour les Stem Count ou Flow Count Fluorospheres 1 Sur l écran Acquisition Run exécution de l acquisition sélectionner Se...

Page 15: ...rol Control Cells La méthode de coloration et le processus de lyse sont maintenant validés Exemple Concentration en Stem Trol Control Cells 1 380 cellules µL Plage de valeurs acceptées 1 173 1 587 1 380 207 cellules µL La valeur absolue normalisée 1 240 cellules µL appartient à la plage IMPORTANT Si la valeur absolue des Stem Trol Control Cells ne fait pas partie de la plage de valeurs autorisées ...

Page 16: ...lisiert wurden um die CD34 Klasse III Epitope 2 und das allgemeine CD45 Leukozyten Antigen bei Dichtigkeiten von annähernd normalen unreifen menschlichen blutbildenden Zellen wiederzugeben Eine Mischung aus Stem Trol Control Cells die in normales frisches Vollblut eingeimpft wurden wird zuerst mit den monoklonalen Antikörper Reagenzien und 7 AAD Viability Dye Vitalitätsfarbstoff eingefärbt und ans...

Page 17: ...chlossen und bei 2 bis 8 C aufbewahrt werden Nicht einfrieren Die Stem Trol Control Cells vor der Verwendung auf Raumtemperatur 18 25 C bringen WICHTIG Es besteht das Risiko fehlerhafter Ergebnisse wenn Leckagen der Stem Trol Control Cells auftreten Nach dem Öffnen müssen die Stem Trol Control Cells aufrecht gelagert werden um mögliche Leckagen zu vermeiden Reagenzien dürfen nicht mehr verwendet w...

Page 18: ...CD45 FITC CD34 PE in das Probenröhrchen pipettieren 2 20 µL 7 AAD Viability Dye Vitalitätsfarbstoff in das Probenröhrchen pipettieren WICHTIG Es besteht das Risiko einer unvollständigen Lysierung wenn Blutproben oben oder an der Seite des Probenröhrchens verbleiben Beim Pipettieren vorsichtig vorgehen um zu verhindern dass Blut an die Oberseite oder an die Seite des Probenröhrchens gelangt Das Pro...

Page 19: ...n 620 nm Bandpassfilter benutzen Für den FL4 Kanal für die Überwachung von 7 AAD Viability Dye Vitalitätsfarbstoff einen 675 nm langen Passfilter benutzen ANMERKUNG Für die Stem Trol Control Cells muss dasselbe Gate Schema und dieselbe Reihe mit 8 Histogrammen wie für die Probenanalyse angegeben befolgt werden Da Stem Trol Control Cells ähnliche Größenmerkmale aufweisen und CD45 und CD34 Antigene ...

Page 20: ...ion H für Histogramm 5 erstellen um alle Stem Count oder Flow Count Fluorospheres einschließlich Dubletten einzuschließen Region H muss sich in der rechten oberen Ecke von Histogramm 5 befinden ANMERKUNG Sicherstellen dass Region H als Region vom Typ AMORPHOUS amorph gezeichnet wird 8 Histogramm 6 Region D aus Histogramm 4 als Region F in Histogramm 6 kopieren 9 Histogramm 7 Eine geradlinige Regio...

Page 21: ...Berechnung als Name der Region G für Singuletten der Stem Count oder Flow Count Fluorospheres und den Wert beispielsweise 1000 in das Feld CAL FACTOR Berechnungsfaktor im Dialogfeld STATISTICS Statistik im Menü SET UP SCREEN PROTOCOL Protokoll Einrichtungsbildschirm eingeben Erfassung von CAL Factor Berechnungsfaktor für Stem Count oder Flow Count Fluorospheres 1 Auf dem Bildschirm Acquisition Run...

Page 22: ...rhalb einer Abweichung von 15 der Assay Konzentration der Stem Trol Control Cells liegen Die Verfärbungsmethode und der Lysierungsprozess werden jetzt überprüft Beispiel Assay Konzentration der Stem Trol Control Cells 1380 Zellen µL Bereich annehmbarer Werte 1173 1587 1380 207 Zellen µL Die normalisierte Absolutzahl 1240 Zellen µL liegt innerhalb des Bereichs WICHTIG Wenn die Absolutzahl der Stem ...

Page 23: ...stabilizzate per esprimere epitopi CD34 classe III 2 e antigene comune del leucocita CD45 a densità simili a quelle delle cellule ematopoietiche normali umane immature Una miscela di Stem Trol Control Cells aggiunta nel sangue intero fresco normale viene dapprima colorata con reagenti di anticorpi monoclonali e con il colorante di vitalità 7 AAD quindi lisata per rimuovere gli eritrociti Per la de...

Page 24: ...tare Stem Trol Control Cells a temperatura ambiente 18 25 C IMPORTANTE Rischio di risultati errati in caso di perdita di Stem Trol Control Cells Una volta aperto Stem Trol Control Cells va conservato in posizione verticale in modo da evitare la possibilità di perdite Non utilizzare i reagenti in caso di eventuali perdite Segni di deterioramento L incapacità di ottenere i risultati attesi o una var...

Page 25: ...ncompleta Fare attenzione durante la pipettatura onde evitare che il sangue tocchi la parte superiore o laterale della provetta test Per rimuovere tutte le tracce del campione di sangue dalla parte superiore o laterale della provetta test se necessario pulire la provetta con un tampone di cotone 3 Nella parte inferiore della provetta pipettare accuratamente 100 µL di campione di sangue intero norm...

Page 26: ...gioni lungo i canali di Forward Scatter Scatter frontale Fluorescence 1 Fluorescenza 1 e Fluorescence 2 Fluorescenza 2 Tuttavia poiché le caratteristiche di Side Scatter Scatter laterale di Stem Trol Control Cells sono univoche è possibile regolare i confini delle regioni lungo il Side Scatter Scatter laterale Le regioni A B C e D per la definizione della regione consultare la sezione Creazione de...

Page 27: ...stogramma 8 per separare i leucociti vitali eventi negativi 7 AAD dagli eventi non vitali soprattutto Stem Trol Control Cells positivo per colorazione 7 AAD Creazione delle Finestre di Analisi Creare i gate come segue 1 Istogramma 1 Assegnare H all istogramma 1 per visualizzare tutti gli eventi ad eccezione di Stem Count o Flow Count Fluorospheres Fare riferimento al manuale dello strumento per la...

Page 28: ...Y 6 Quando richiesto digitare Y per sì Quando vengono acquisiti almeno 1 000 singoletti di fluorosfere la conta assoluta di CD34 Stem Trol Control Cells viene regolata automaticamente ed è possibile estrapolarla direttamente dai risultati stampati delle statistiche della regione D Tabella di seguito Esempio di statistica ottenuta con la provetta TROL 45 34 7 AAD nel software System II utilizzando ...

Page 29: ...ta di Stem Trol Control Cells non rientra nell intervallo di valori accettati determinare se la pipettatura è stata eseguita correttamente soprattutto per Stem Count o Flow Count Fluorospheres e Stem Trol Control Cells Verificare visivamente i report del citometro a flusso e la qualità della colorazione e della procedura di lisi nelle provette test Verificare in che modo sono stati definiti i conf...

Page 30: ...eservadas que se han modificado y estabilizado para expresar los epítopos CD34 de clase III 2 y el antígeno común leucocitario CD45 en densidades que se aproximan a la de las células hematopoyéticas humanas inmaduras normales Primero se tiñe una mezcla de Stem Trol Control Cells inyectada en sangre total fresca normal con los reactivos de anticuerpos monoclonales y el marcador de viabilidad 7 AAD ...

Page 31: ...s El frasco abierto debe cerrarse herméticamente y conservarse a una temperatura entre 2 y 8 C después de la utilización No congelar Exponga a las Stem Trol Control Cells a una temperatura ambiente entre 18 y 25 C antes de su utilización IMPORTANTE Existe riesgo de resultados erróneos ante la fuga de Stem Trol Control Cells Una vez abiertas las Stem Trol Control Cells deben almacenarse en una posi...

Page 32: ...boratorio Los reactivos de control y los anticuerpos deben estar a temperatura ambiente Para cada experimento etiquete un tubo de muestra TROL 45 34 7 AAD 1 Pipetee 20 µL de CD45 FITC CD34 PE en el tubo de muestra 2 Pipetee 20 µL de marcador de viabilidad 7 AAD en el tubo de muestra IMPORTANTE Existe un riesgo de lisis incompleta si la muestra sanguínea permanece en la parte superior o lateral del...

Page 33: ...ENTANAS Y DE ANÁLISIS Configuración del protocolo de análisis El citómetro de flujo debe estar equipado para detectar dispersión de luz frontal dispersión lateral de luz y cuatro canales de fluorescencia Para el canal FL3 para la detección de las Stem Count o Flow Count Fluorospheres utilice un filtro band pass 620 nm Para el canal FL4 para la detección del marcador de viabilidad 7 AAD utilice un ...

Page 34: ...sión de CD45 en los eventos CD34 7 Histograma 5 Crear la Región H amorfa en el Histograma 5 que englobe todas las Stem Count o Flow Count Fluorospheres incluidos los dobletes La Región H se debe situarse en el ángulo superior derecho del Histograma 5 NOTA Asegúrese de que la Región H esté diseñada como una región AMORPHOUS AMORFA 8 Histograma 6 Copiar la Región D del Histograma 4 como Región F en ...

Page 35: ... la citometría de flujo COULTER EPICS XL XL MCL se debe introducir la concentración ensayada correcta de Stem Count o Flow Count Fluorospheres antes de la adquisición de la muestra Introduzca CAL como el nombre de los singletes de las Stem Count o Flow Count Fluorospheres de la Región G entre por ejemplo el valor 1000 en el cuadro CAL FACTOR FACTOR CAL en la pantalla de diálogo STATISTICS ESTADÍST...

Page 36: ...Control Cells obtenido debe oscilar en un rango aproximado del 15 de la concentración ensayada de las Stem Trol Control Cells El método de tinción y el proceso de lisis son válidos en estos momentos Ejemplo La concentración ensayada de Stem Trol Control Cells 1380 cel µL Rango de los valores aceptados 1173 1587 1380 207 cel µL El recuento absoluto normalizado 1240 cel µL está dentro del rango IMPO...

Page 37: ...B60231 AE 37 of 128 Lista de símbolos El glosario de símbolos está disponible en beckman com techdocs número de documento B60062 ...

Page 38: ...ue foram modificadas e estabilizadas para expressar epítopos CD34 da classe III 2 e o antigénio comum de leucócitos CD45 a densidades semelhantes às das células hematopoiéticas humanas imaturas normais Uma mistura de Stem Trol Control Cells com sangue total novo normal é primeiramente submetida a coloração com os reagentes de anticorpos monoclonais e marcador de viabilidade 7 AAD e posteriormente ...

Page 39: ... abertos devem ser armazenados bem fechados e a uma temperatura entre 2 e 8 C após a utilização Não congelar Coloque as Stem Trol Control Cells à temperatura ambiente 18 a 25 C antes da utilização IMPORTANTE Risco de resultados errados se ocorrer uma fuga de Stem Trol Control Cells Após a abertura as Stem Trol Control Cells devem ser armazenadas na vertical para evitar a possibilidade de fugas Os ...

Page 40: ... 7 AAD para o tubo de amostra IMPORTANTE Risco de lise incompleta se um existir espécime de sangue na parte superior ou lateral do tubo de ensaio Proceda com cuidado ao pipetar para impedir que o sangue toque na parte superior ou lateral do tubo de ensaio Limpe o tubo de amostra com um cotonete se necessário para eliminar todos os vestígios de espécime de sangue das partes superior ou lateral do t...

Page 41: ...rol Cells deve seguir se o mesmo esquema de delimitação e a mesma série de 8 histogramas indicados para a análise de espécimes Como as Stem Trol Control Cells possuem caraterísticas dimensionais semelhantes às das células hematopoiéticas imaturas normais e expressam antigénios CD45 e CD34 em densidades que se aproximam das mesmas não é necessário modificar os limites de região para os canais Forwa...

Page 42: ...perior direito do Histograma 5 NOTA Certifique se de que a Região H está definida como uma região AMORPHOUS Amorfa 8 Histograma 6 Copie a Região D do Histograma 4 para que apareça como Região F no Histograma 6 9 Histograma 7 Crie uma Região G retilínea no Histograma 7 para incluir apenas singletos de Stem Count Fluorospheres ou Flow Count Fluorospheres A Região G pode ser identificada como CAL Cal...

Page 43: ... o nome da Região G de singletos de Stem Count Fluorospheres ou Flow Count Fluorospheres e introduza um valor de por exemplo 1000 na caixa CAL FACTOR Fator de calibração no ecrã de diálogo STATISTICS Estatísticas do menu SET UP SCREEN PROTOCOL Protocolo de ecrã de configuração Introduzir o CAL Factor Fator de calibração para Stem Count Fluorospheres ou Flow Count Fluorospheres 1 No ecrã Acquisitio...

Page 44: ...5 da concentração ensaiada de Stem Trol Control Cells O método de coloração e o processo de lise estão agora validados Exemplo Concentração ensaiada de Stem Trol Control Cells 1380 células µL Intervalo de valores aceites 1173 1587 1380 207 células µL A contagem absoluta normalizada 1240 células µL está dentro do intervalo IMPORTANTE Se a contagem absoluta de Stem Trol Control Cells se situar fora ...

Page 45: ...der ligger tæt på normale umodne menneskelige hæmatopoietiske celler En blanding af Stem Trol Control Cells tilført normalt frisk helblod farves først med monoklonale antistofreagenser samt 7 AAD Viability Dye og lyseres derefter for at fjerne erytrocytterne Der tilsættes Stem Count eller Flow Count Fluorospheres for direkte at kunne bestemme de absolutte tællinger Flowcytometeranalysen af den far...

Page 46: ...ontrol Cells nå rumtemperatur 18 25 C før brug VIGTIGT Der er risiko for fejlagtige resultater hvis der forekommer udsivning fra Stem Trol Control Cells Når Stem Trol Control Cells er blevet åbnet skal de opbevares i en opretstående stilling for at forhindre eventuel udsivning Reagenser må ikke benyttes hvis der er tegn på udsivning Tegn på nedbrydning Hvis de forventede resultater ikke kan opnås ...

Page 47: ...vis det er nødvendigt for at fjerne alle spor af blodpræparatet fra prøverørets top eller side 3 Pipettér nøjagtigt 100 µL velblandet prøve af normalt helblod ved hjælp af en kalibreret positiv pipette til overførsel eller pipette til gentagelse ned i bunden af prøverøret 4 Klargør og tilføj Stem Trol Vortex Stem Trol Control Cells i 5 sekunder Pipettér nøjagtigt 20 µL Stem Trol Control Cells ned ...

Page 48: ...ttelse af region for definition af region skal ændres for at inkludere Stem Trol Control Cells karakteristiske klynger Oprettelse af histogram Opret histogrammer på følgende måde 1 Opret histogram 1 som FL1 CD45 FITC vs Side Scatter sidelæns spredning 2 Opret histogram 2 som FL2 CD34 PE vs Side Scatter sidelæns spredning 3 Opret histogram 3 som FL1 CD45 FITC vs Side Scatter sidelæns spredning 4 Op...

Page 49: ...1 bogstavet H for at vise alle hændelser undtagen alle Stem Count eller Flow Count Fluorospheres Se instruments brugervejledning om oprettelse af not gates 2 Histogram 2 Tildel histogram 2 bogstavet A for at vise alle CD45 hændelser 3 Histogram 3 Tildel histogram 3 bogstavet A og B AB for at vise alle CD45 CD34 hændelser 4 Histogram 4 Tildel histogram 4 bogstaverne A B og C ABC for at vise alle CD...

Page 50: ...evne resultater over region D statistikker Tabel herunder Eksempler på statistikker med prøverør TROL 45 34 7 AAD på System II software ved hjælp af funktionen CAL FACTOR CAL faktor hvor 1024 er den analyserede koncentration Stem Count Fluorospheres 5248 er det samlede antal fluorofærer der akkumuleres i CAL regionen i løbet af hele hentningstiden I dette eksempel er alle tællinger justeret med 10...

Page 51: ... for accepterede værdier skal det afgøres om pipetteringen har været udført korrekt især for Stem Count eller Flow Count Fluorospheres og Stem Trol Control Cells Kontrollér visuelt flowcytometerrapporterne og kvaliteten af farvnings og lyseringsprocessen i prøverørene Kontrollér hvordan regionens grænser blev indstillet Gentag klargøringen hvis det er nødvendigt med nye prøverør Indhent og analysé...

Page 52: ...tiska celler En blandning av Stem Trol Control Cells tillsatta till normalt färskt helblod färgas först med de monoklonala antikroppsreagenserna och 7 AAD viabilitetsfärg och lyseras sedan i syfte att ta bort erytrocyter Stem Count eller Flow Count Fluorospheres tillsätts för direkt bestämning av absoluta antal Det absoluta antalet målceller bestäms med flödescytometrisk analys av den färgade och ...

Page 53: ...har öppnats måste de förvaras i upprätt läge för att förhindra risken för läckage Använd inte reagenser om det finns tecken på läckage Tecken på försämring Oförmåga att erhålla förväntade resultat eller en förändring i ljusspridnings eller fluorescensegenskaper kan tyda på produktförsämring Även instrumentstandardisering provberedningsteknik och antikroppsprestanda bör undersökas Varje förändring ...

Page 54: ...ggrant 100 µL av ett väl blandat normalt helblodsprov till provrörets botten med en kalibrerad positiv förskjutningspipett eller repeater pipett 4 Bered och tillsätt Stem Trol Vortexa Stem Trol Control Cells i 5 sekunder Pipettera noggrant 20 µL Stem Trol Control Cells till provröret Vortexa provrören i 5 sekunder 5 Inkubera vid rumstemperatur 18 25 C i 20 minuter i skydd mot ljus 6 Tillsätt 2 mL ...

Page 55: ...as se avsnittet Skapa regioner för definition av regioner så att de inkluderar Stem Trol Control Cells karaktäristiska kluster Skapa Histogram Skapa histogram enligt följande 1 Skapa histogram 1 som FL1 CD45 FITC vs Side Scatter sidospridning 2 Skapa histogram 2 som FL2 CD34 PE vs Side Scatter sidospridning 3 Skapa histogram 3 som FL1 CD45 FITC vs Side Scatter sidospridning 4 Skapa histogram 4 som...

Page 56: ...ör anvisningar om att skapa not gates 2 Histogram 2 tilldela A till histogram 2 för visning av alla CD45 händelser 3 Histogram 3 tilldela A och B AB till histogram 3 för visning av alla CD45 CD34 händelser 4 Histogram 4 tilldela A och B och C ABC till histogram 4 för visning av alla CD45 CD34 klusterhändelser med låg till medelhög side scatter sidospridning och lågt CD45 färgningsuttryck Händelser...

Page 57: ...aktor där 1 024 är Stem Count Fluorospheres analyserade koncentration 5 248 är det totala antalet fluorosfärer ackumulerade i CAL regionen kalibreringsregionen under hela insamlingstiden I det här exemplet är alla antal justerade med 1 024 5 248 Statistik Ej normaliserat histogram Listgating region ID avaktiverat Antal justerade celler µL 1 A LEUKS 9 798 2 B CD34 POS 279 3 C CD45 DIM 264 4 D Stem ...

Page 58: ...ount eller Flow Count Fluorospheres och Stem Trol Control Cells Kontrollera visuellt flödescytometerns rapporter och kvaliteten på färgnings och lyseringsprocessen i provrören Kontrollera på vilket sätt regionernas gränser ställdes in Upprepa vid behov beredningen med nya provrör Samla in och analysera både den nya serien provrör och den föregående serien Jämför de båda resultaten Om överensstämme...

Page 59: ...ουν έκφραση αντιγόνων και ιδιότητες χρώσης των CD45 και CD34 οι οποίες είναι αντιπροσωπευτικές εκείνων που απαντώνται στα CD34 HPC ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Τα Stem Trol Control Cells είναι διατηρημένα κύτταρα KG 1a που έχουν τροποποιηθεί και σταθεροποιηθεί για την έκφραση επιτόπων CD34 κατηγορίας III 2 και του κοινού λευκοκυτταρικού αντιγόνου CD45 σε πυκνότητες που προσεγγίζουν τα φυσιολογικά πρώιμα α...

Page 60: ...ον καθορισμό των αναμενόμενων αποτελεσμάτων μπορεί να μην πέσουν μέσα στο αναμενόμενο εύρος 14 Κατά τον χειρισμό του παρόντος αντιδραστηρίου χρησιμοποιείτε τις ορθές εργαστηριακές πρακτικές ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΕΠΙΚΙΝΔΥΝΟΤΗΤΑΣ ΚΑΤΑ ΠΕΣ Δεν ταξινομείται ως επικίνδυνο Το Φύλλο Δεδομένων Ασφάλειας είναι διαθέσιμο στη διεύθυνση beckman com techdocs ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΑΠΟΡΡΙΨΗ Σταθερότητα αντιδραστηρίου ...

Page 61: ... και χρησιμοποιώντας ένα φυσιολογικό δείγμα περιφερικού αίματος από υγιή δότη Επιπλέον καθώς το Stem Trol Control Cells είναι σταθεροποιημένα κύτταρα δηλ μη βιώσιμα κύτταρα μπορείτε να ελέγχετε οπτικά τη χρώση με χρωστική βιωσιμότητας 7 AAD στο Stem Trol Control Cells βλ ενότητα Δημιουργία ιστογράμματος Εξασφαλίστε ότι το κυτταρόμετρο ροής είναι σωστά ευθυγραμμισμένο και τυποποιημένο για την έντασ...

Page 62: ...0 µL Stem Count ή Flow Count Fluorospheres στο σωληνάριο 11 Περιδινήστε για 5 δευτερόλεπτα αμέσως μετά από κάθε προσθήκη Φυλάξτε σε θερμοκρασία 2 8 C Επαναλάβετε την περιδίνηση αμέσως πριν από τη λήψη της κυτταρομετρίας ροής ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ Υπάρχει κίνδυνος εσφαλμένων αποτελεσμάτων σε περίπτωση ανάλυσης ενός δείγματος πάνω από 1 ώρα μετά την προσθήκη των Stem Count ή Flow Count Fluorospheres Τα παρασκευ...

Page 63: ...λάγιας σκέδασης Τα Ιστογράμματα 1 έως 4 προορίζονται για τον χαρακτηρισμό των CD34 HPC μια διαδικασία που μπορεί να καθυστερήσει μέχρι το βήμα της ανάλυσης Αυτά τα τέσσερα πρώτα ιστογράμματα διαμορφώνονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες της ISHAGE για τον προσδιορισμό των κυττάρων CD34 με κυτταρομετρία ροής 2 3 Τα Ιστογράμματα 5 έως 7 προορίζονται για την παρακολούθηση των παραμέτρων που εί...

Page 64: ...λή όλων των Stem Count ή Flow Count Fluorospheres συμπεριλαμβανομένων των διπλών 8 Ιστόγραμμα 8 Αντιστοιχίστε το A στο Ιστόγραμμα 8 για προβολή των συμβάντων CD45 Ρύθμιση κυτταρόμετρου ροής 1 Εξασφαλίστε ότι το κυτταρόμετρο ροής είναι σωστά ευθυγραμμισμένο και τυποποιημένο για τη σκέδαση φωτός και την ένταση φθορισμού σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες του κατασκευαστή και του εργαστηρίου Επαλη...

Page 65: ...το παράδειγμα όλες οι τιμές έχουν προσαρμοστεί κατά 1 024 5 248 Στατιστικά στοιχεία Μη κανονικοποιημένο ιστόγραμμα Listgating Αναγνωριστικό αποκλεισμένης περιοχής Προσαρμοσμένες τιμές κύτταρα µL 1 A LEUKS 9 798 2 B CD34 POS 279 3 C CD45 DIM 264 4 D Stem Trol Control Cells 248 7 G CAL 1024 1 024 5 H Όλα τα Stem Count Fluorospheres 1 046 1 Καταγράψτε τους προσαρμοσμένους απόλυτους αριθμούς κύτταρα µ...

Page 66: ...αι το Stem Trol Control Cells Ελέγξτε οπτικά τις αναφορές του κυτταρόμετρου ροής και τα δοκιμαστικά σωληνάρια ως προς την ποιότητα των διαδικασιών χρώσης και λύσης Επαληθεύστε τον τρόπο με τον οποίον ορίστηκαν τα όρια της περιοχής Εάν χρειάζεται επαναλάβετε την παρασκευή χρησιμοποιώντας νέα δοκιμαστικά σωληνάρια Πραγματοποιήστε λήψη και ανάλυση τόσο της νέας όσο και της προηγούμενης σειράς σωληναρ...

Page 67: ...ez hozzáadott Stem Trol Control Cells keverékét először megfestik monoklonális antitest reagensekkel és 7 AAD vitális festékkel majd lizálják a vörösvértestek eltávolítása céljából A Stem Count vagy Flow Count Fluorospheres gömbök hozzáadása az abszolút számok közvetlen meghatározása céljából történik A festett és lizált sejtkészítmény áramlási citometriás vizsgálatával határozható meg a célsejtek...

Page 68: ...ells oldatot álló helyzetben kell tárolni az esetleges szivárgás megakadályozására Nem szabad a reagenst használni ha szivárgásra utaló jelek láthatók A minőségromlás jelei Ha nem sikerül a várt eredményeket kapni vagy a fényszórási vagy a fluoreszcenciás tulajdonságok értékében eltolódás mutatkozik ez a termék bomlását jelezheti Meg kell vizsgálni a készülék standardizálását a mintakészítési móds...

Page 69: ...y a vérminta ne érintse a kémcső tetejét vagy oldalát Szükség esetén a kémcső tetején vagy oldalán maradt vérminta eltávolítása céljából tisztítsa meg a kémcsövet vattapálcával 3 A cső aljába pipettázzon pontosan 100 µL jól elkevert normális teljesvér mintát kalibrált pozitív kiszorításos vagy ismétlő pipetta használatával 4 A Stem Trol oldat előkészítése és hozzáadása 5 másodpercig vortexelje a S...

Page 70: ...uoreszcencia 2 csatorna területi határait Mivel azonban a Stem Trol Control Cells Side Scatter oldalra szóródási jellemzői egyediek módosíthatók a területhatárok a Side Scatter oldalra szóródás mentén Az A B C és D területet a definíciót lásd a Területek létrehozása fejezetben módosítani kell hogy tartalmazzák a Stem Trol Control Cells jellemző csoportját Hisztogram létrehozása Hozzon létre hiszto...

Page 71: ...yedi Stem Count vagy Flow Count Fluorospheres gömböket tartalmazza A G területnek adható a CAL címke hogy lehetővé tegye a CD34 HPC események abszolút számának automatikus számítását további részletek a készülék kézikönyvében találhatók 10 8 hisztogram Hozza létre az egyenes vonalakkal határolt J területet a 8 hisztogramon az élő fehérvérsejteknek 7 AAD negatív események a nem élő főként 7 AAD fes...

Page 72: ...Statisztika párbeszédpanelen A CAL FACTOR CAL faktor megadása a Stem Count vagy Flow Count Fluorospheres esetén 1 Az Acquisition Run Adatgyűjtés futtatása képernyőn válassza ki a Setup Beállítás Protocol Protokoll lehetőséget 2 Válassza a STATISTICS Statisztika CAL FACTOR CAL faktor lehetőséget 3 Adja meg a Stem Count vagy Flow Count Fluorospheres üvegen található CAL FACTOR CAL faktor számot vizs...

Page 73: ...ontrol Cells vizsgálati koncentrációja 1380 sejt µL Elfogadható értéktartomány 1173 1587 1380 207 sejt µL A normalizált abszolút szám 1240 sejt µL a tartományon belül van FONTOS Ha a Stem Trol Control Cells abszolút száma az elfogadható értéktartományon kívül esik állapítsa meg hogy a pipettázást megfelelően végezték e főként a Stem Count vagy Flow Count Fluorospheres és a Stem Trol Control Cells ...

Page 74: ...ane i stabilizowane w celu ekspresji epitopów CD34 klasy III 2 i wspólnych alergenów leukocytów CD45 przy gęstościach które są zbliżone do prawidłowych niedojrzałych ludzkich komórek szpiku Mieszanina komórek kontrolnych Stem Trol Control Cells dodanych do prawidłowej świeżej krwi pełnej jest najpierw barwiona odczynnikami przeciwciała monoklonalnego i barwnikiem żywotności 7 AAD Viability Dye a n...

Page 75: ... otwartej fiolce wynosi 30 dni Otwarte fiolki muszą być szczelnie zamykane i po użyciu przechowywane w temperaturze 2 8 C Produktu nie należy zamrażać Przed użyciem doprowadzić komórki kontrolne Stem Trol Control Cells do temperatury pokojowej 18 25 C WAŻNE W przypadku wystąpienia wycieku komórek kontrolnych Stem Trol Control Cells istnieje ryzyko błędnych wyników Po otwarciu komórki kontrolne Ste...

Page 76: ...luorescencji są prawidłowo ustawione zgodnie z wytycznymi producenta i laboratoryjnymi Doprowadzić odczynnik kontrolny i przeciwciała do temperatury pokojowej Dla każdego analizatora oznaczyć jedną probówkę TROL 45 34 7 AAD 1 Pipetować 20 µL odczynnika CD45 FITC CD34 PE do probówki 2 Dodać do probówki 20 µL barwnika żywotności 7 AAD Viability Dye WAŻNE Jeżeli próbka krwi pozostaje na górze lub ści...

Page 77: ...eksować Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut Chronić przed światłem Stem Count Fluorospheres 100 µL BRAMKOWANIE MANUALNE I METODA ANALIZY Konfiguracja protokołu Cytometr przepływowy musi być wyposażony w możliwość detekcji rozpraszania do przodu rozpraszania bocznego oraz czterech kanałów fluorescencji Dla kanału FL3 do monitorowania wartości Stem Count lub Flow Count Fluorospheres uż...

Page 78: ...cznego Regionu C na Histogramie 3 aby włączyć wszystkie zgrupowane zdarzenia CD45dim 5 Histogram 4 Tworzenie amorficznego regionu D na Histogramie 4 w celu uwzględnienia wszystkich grupowanych zdarzeń z pośrednim rozpraszaniem bocznym i pośrednim do wysokiego rozpraszaniem do przodu 6 Histogram 5 Tworzenie regionu I Quadstat na Histogramie 5 w celu weryfikacji dolnej granicy ekspresji CD45 na zdar...

Page 79: ...Count Fluorospheres uzyskanych przy użyciu oprogramowania System II wersja 3 0 i cytometru przepływowego COULTER EPICS XL XLMCL W celu uzyskania automatycznie obliczonych oznaczeń liczb bezwzględnych na cytometrach przepływowych COULTER EPICS XL XL MCL przed akwizycją próbki należy wprowadzić prawidłowe stężenie oznaczane fluorokulek Stem Count lub Flow Count Fluorospheres Wprowadzić CAL jako nazw...

Page 80: ...ane stężenie komórek µL podane na etykiecie fiolki Uzyskana liczba bezwzględna komórek kontrolnych Stem Trol Control Cells musi być w granicach 15 oznaczonego stężenia komórek kontrolnych Stem Trol Control Metoda barwienia i proces lizy są teraz zwalidowane Przykład Oznaczane stężenie komórek kontrolnych Stem Trol Control Cells 1380 komórek µL Zakres dopuszczalnych wartości 1173 1587 1380 207 komó...

Page 81: ...B60231 AE 81 of 128 Legenda symboli Słowniczek symboli jest dostępny pod adresem beckman com techdocs numer dokumentu B60062 ...

Page 82: ...řídy III 2 a společný antigen leukocytu CD45 při hustotě která přibližně odpovídá normálním nezralým lidským hematopoietickým buňkám Směs buněk Stem Trol Control Cells použitá k obohacení normální čerstvé plné krve je nejprve obarvena reagenciemi monoklonální protilátky a barvivem pro určení životnosti buněk 7 AAD a poté lyzována s cílem odstranit erytrocyty Přípravek Stem Count nebo Flow Count Fl...

Page 83: ...ol Cells Po otevření musí být buňky Stem Trol Control Cells skladovány ve svislé poloze aby se zabránilo úniku Reagencie by se neměly používat jsou li na nich zjištěny známky úniku Známky znehodnocení Nemožnost dosažení očekávaných výsledků nebo posun rozptylu světla či vlastností fluorescence mohou znamenat nižší kvalitu produktu Měla by být prověřena také standardizace přístroje technologie příp...

Page 84: ...y pipetou přesně přeneste 100 µl dobře promíchaného vzorku normální plné krve s použitím kalibrované pipety s pozitivním nesprávným umístěním nebo opakovací pipety 4 Připravte a přidejte přípravek Stem Trol Míchejte buňky Stem Trol Control Cells po dobu 5 sekund Do zkumavky pipetou přesně přeneste 20 µl buněk Stem Trol Control Cells Zkumavky míchejte po dobu 5 sekund 5 Inkubujte 20 minut při labor...

Page 85: ... s charakteristikou buněk Stem Trol Control Cells Vytvoření histogramů Vytvořte histogramy následujícím způsobem 1 Pomocí parametrů FL1 CD45 FITC vs Side Scatter kolmý rozptyl vytvořte histogram 1 2 Pomocí parametrů FL2 CD34 PE vs Side Scatter kolmý rozptyl vytvořte histogram 2 3 Pomocí parametrů FL1 CD45 FITC vs Side Scatter kolmý rozptyl vytvořte histogram 3 4 Pomocí parametrů Forward Scatter př...

Page 86: ...ření gatů Následujícím způsobem vytvořte gaty 1 Histogram 1 přiřaďte položku H k histogramu 1 aby se zobrazovaly všechny události kromě přípravků Stem Count nebo Flow Count Fluorospheres Pokyny ohledně vytváření položek not gates položky které nejsou gaty naleznete v příručce k přístroji 2 Histogram 2 přiřaďte položku A k histogramu 2 aby se zobrazovaly všechny události CD45 3 Histogram 3 přiřaďte...

Page 87: ...su ENTER 5 Vyberte možnost OKAY OK 6 Po zobrazení výzvy zadejte znak Y ano Po získání alespoň 1000 singletů fluorescenčních částic je automaticky upraven absolutní počet pro buňky Stem Trol Control Cells CD34 a lze jej převzít přímo z výsledků ve výtisku statistiky pro oblast D Tabulka viz níže Příklad statistiky zjištěné s použitím zkumavky TROL 45 34 7 AAD v softwaru System II s použitím funkce ...

Page 88: ...počet buněk Stem Trol Control Cells leží mimo rozsah přijatelných hodnot ověřte že bylo pipetování provedeno správně a to zejména pro přípravek Stem Count nebo Flow Count Fluorospheres a pro buňky Stem Trol Control Cells Vizuálně zkontrolujte zprávy průtokového cytometru a kvalitu procesu obarvování a lýzy ve zkumavkách Ověřte způsob nastavení hranic oblastí V případě potřeby zopakujte přípravu s ...

Page 89: ...r Normal taze tam kana eklenen Stem Trol Control Cells karışımı ilk olarak monoklonal antikor reaktifleri ve 7 AAD Viability Dye ile boyanır ve ardından eritrositleri yok etmek üzere parçalanır Stem Count veya Flow Count Fluorospheres mutlak sayımların doğrudan belirlenmesi için eklenir Boyanmış ve parçalanmış preparatın akış sitometrik analizi hedeflenen hücrelerin mutlak sayımını belirler Beklen...

Page 90: ...s açıldıktan sonra sızma olasılığını önlemek için dik bir konumda saklanmalıdır Sızıntı belirtileri gözlemlenirse reaktifler kullanılmamalıdır Bozulma Göstergesi Beklenen sonuçların alınamaması veya ışık saçılması ya da floresan özelliklerindeki kayma ürünün bozulduğunu gösterebilir Cihaz standardizasyonu örnek hazırlama tekniği ve antikor performansı da araştırılmalıdır Stem Trol Control Cells in...

Page 91: ...bre edilmiş pozitif kaydırma veya tekrarlama pipeti kullanarak tüpün dibine 100 µL iyi karıştırılmış normal tam kan örneğini pipetleyin 4 Stem Trol ü hazırlayıp ekleyin Stem Trol Control Cells i 5 saniye boyunca vorteksleyin Tüpün içine 20 µL Stem Trol Control Cells pipetleyin Tüpleri 5 saniye boyunca vorteksleyin 5 Oda sıcaklığında 18 25 C ışıktan koruyarak 20 dakika boyunca inkübe edin 6 Tüpe 2 ...

Page 92: ...ik kümesini içerecek şekilde değiştirilmelidir Histogram Oluşturma Histogramları aşağıdaki gibi oluşturun 1 FL1 CD45 FITC ye karşılık Side Scatter Yan Saçılma olarak Histogram 1 i oluşturun 2 FL2 CD34 PE ye karşılık Side Scatter Yana Saçılma olarak Histogram 2 yi oluşturun 3 FL1 CD45 FITC ye karşılık Side Scatter Yan Saçılma olarak Histogram 3 i oluşturun 4 Forward Scatter a Öne Saçılma karşılık S...

Page 93: ...kın 2 Histogram 2 Tüm CD45 olaylarını görüntülemek için Histogram 2 ye A atayın 3 Histogram 3 Tüm CD45 CD34 olaylarını görüntülemek için Histogram 3 e A ve B AB atayın 4 Histogram 4 Düşük ila ara yan saçılma ve düşük CD45 boyama ekspresyonuna sahip tüm CD45 CD34 kümelenmiş olaylarını görüntülemek için Histogram 4 e A ve B ve C ABC atayın ABCD Bölgesindeki olaylar gerçek CD34 HPC dir 5 Histogram 5 ...

Page 94: ...ği burada 1024 Stem Count Fluorospheres Test Edilen Konsantrasyonudur 5248 tam edinme süresi boyunca CAL bölgesinde biriken toplan florosfer sayısıdır Bu örnekte tüm sayımlar şuna göre ayarlanmıştır 1024 5248 Stats İstatistikler Not Normalized Hist Normalleştirilmemiş Histogram Liste geçitleme Bölge Kimliği Devre Dışı Counts Adjusted Ayarlanan Sayımlar Hücre µL 1 A LEUKS 9 798 2 B CD34 POS 279 3 C...

Page 95: ...ntrol Cells için olmak üzere pipetlemenin doğru şekilde gerçekleştirilip gerçekleştirilmediğini belirleyin Akış sitometresi raporlarını ve test tüplerinizdeki boyama ve parçalama işleminin kalitesini görsel olarak kontrol edin Bölge sınırlarının ayarlanma yöntemini doğrulayın Gerekirse preparatı yeni test tüpleriyle tekrarlayın Hem yeni hem de önceki tüp serilerini edinin ve analiz edin İki sonucu...

Page 96: ...45 и CD34 репрезентативные для гематопоэтических клеток предшественников CD34 ПРИНЦИП Контрольные клетки Stem Trol Control Cells являются консервированными клетками KG 1a которые были модифицированы и стабилизированы для экспрессии эпитопов CD34 класса III 2 и общего антигена лейкоцитов CD45 с плотностью приближающейся к нормальным незрелым человеческим кроветворным клеткам Смесь контрольных клето...

Page 97: ...щество Паспорт безопасности доступен на сайте beckman com techdocs ХРАНЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТЬ И УТИЛИЗАЦИЯ Стабильность реагента невскрытый реагент стабилен до истечения срока годности указанного на флаконе при хранении при температуре 2 8 C Не используйте по истечении срока хранения Вскрытый флакон стабилен в течение 30 дней Вскрытые флаконы следует после использования плотно закрыть и хранить при тем...

Page 98: ...гистограммы Убедитесь что проточный цитометр надлежащим образом отрегулирован и стандартизирован на интенсивность флуоресценции в соответствии с рекомендациями производителя и лаборатории Убедитесь что настройки компенсации флуоресценции надлежащим образом скорректированы в соответствии с рекомендациями производителя и лаборатории Доведите контрольный реагент и антитела до комнатной температуры Дл...

Page 99: ... мкл Stem Trol Control Cells 20 мкл Обработайте на вортексе инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут Хранить в темном месте 1X NH4Cl Lysing Solution 2 мл Обработайте на вортексе инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут Хранить в темном месте Stem Count Fluorospheres 100 мкл ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕГИОНОВ СЕЛЕКЦИИ ВРУЧНУЮ И МЕТОД АНАЛИЗА Настройка протокола Проточный цитометр ...

Page 100: ...итов и скопления 2 Гистограмма 1 создайте аморфный регион E по лимфоцитам яркие CD45 низкое боковое рассеяние 3 Гистограмма 2 создайте прямолинейный регион B на гистограмме 2 включающий все события CD34 с низким или средним боковым рассеянием Установите предел подсчета 75 000 событий события CD45 на гистограмме 2 4 Гистограмма 3 создайте аморфный регион C на гистограмме 3 включающий все объединенн...

Page 101: ...т проанализировать не менее 75 000 событий CD45 4 Скорректируйте дискриминатор и регионы путем анализа пробирки TROL 45 34 7 AAD Пример анализа Гистограммы содержащиеся в ПРИЛОЖЕНИИ отображаются в порядке возрастания номеров как показано в протоколе Расчет контрольных клеток CD34 Stem Trol Control Cells Использование результатов проточной цитометрии автоматически скорректированных с аналитической ...

Page 102: ...чных данных подсчета синглетов Stem Count Fluorospheres на объем контрольных клеток Stem Trol Control Cells добавленных в тестовую пробирку Пример 100 мкл Stem Count Fluorospheres добавлены к 20 мкл контрольных клеток Stem Trol Control Cells N 100 20 5 Нормализованное абсолютное количество контрольных клеток Stem Trol Control Cells 248 x 5 1240 клеток мкл 3 Проверьте абсолютное количество контроль...

Page 103: ...а результата Если отсутствует соответствие обратитесь в местное представительство компании Beckman Coulter ТОВАРНЫЕ ЗНАКИ Beckman Coulter стилизованный логотип и упоминаемые здесь знаки продукции и услуг Beckman Coulter являются товарными знаками или зарегистрированными товарными знаками корпорации Beckman Coulter в Соединенных Штатах и других странах ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ www beckmancoulter c...

Page 104: ...ietice imature normale umane Un amestec de celule Stem Trol Control Cells îmbogățite în sânge integral proaspăt normal este mai întâi colorat cu reactivi cu anticorpi monoclonali și colorant pentru teste de viabilitate celulară 7 AAD și apoi este lizat pentru a elimina eritrocitele Sunt adăugate Stem Count sau Flow Count Fluorospheres pentru determinare directă a valorilor absolute Analiza citomet...

Page 105: ... După deschidere Stem Trol Control Cells trebuie să fie depozitate în poziție verticală pentru a împiedica scurgerea Reactivii la care se observă urme de scurgere nu trebuie să fie folosiți Dovadă de deteriorare Neobținerea rezultatelor așteptate sau o diferență în proprietăți de dispersie a luminii sau de fluorescență pot indica deteriorarea produsului Trebuie să investigați și standardizarea ins...

Page 106: ... urmele de specimen de sânge din partea de sus sau lateralul eprubetei de test 3 În partea de jos a eprubetei pipetați corect 100 µl dintr o probă de sânge integral normal bine amestecat folosind o pipetă calibrată corespunzător sau o pipetă repetoare 4 Preparați și adăugați Stem Trol Omogenizați Stem Trol Control Cells timp de 5 secunde Pipetați cu precizie 20 µl de Stem Trol Control Cells în epr...

Page 107: ...area regiunii pentru definirea regiunii trebuie să fie modificate pentru a include clusterul de caracteristici Stem Trol Control Cells Crearea histogramei Creați histogramele astfel 1 Creați Histograma 1 ca FL1 CD45 FITC vs Side Scatter Dispersie perpendiculară 2 Creați Histograma 2 ca FL2 CD34 PE vs Side Scatter Dispersie perpendiculară 3 Creați Histograma 3 ca FL1 CD45 FITC vs Side Scatter Dispe...

Page 108: ...e not gates 2 Histograma 2 Atribuiți valoarea A Histogramei 2 pentru a afișa toate evenimentele CD45 3 Histograma 3 Atribuiți valorile A și B AB Histogramei 3 pentru a afișa toate evenimentele CD45 CD34 4 Histograma 4 Atribuiți valorile A B și C ABC Histogramei 4 pentru a afișa toate evenimentele CD45 CD34 din cluster cu dispersie perpendiculară de la scăzută la intermediară și colorare CD45 scăzu...

Page 109: ...est exemplu toate numerele sunt ajustate astfel 1024 5248 Statistici Hist nenormalizată Poartă listă ID regiune dezactivat Numere ajustate celule µl 1 A LEUKS 9798 2 B CD34 POS 279 3 C CD45 DIM 264 4 D Stem Trol Control Cells 248 7 G CAL 1024 1024 5 H Toate Stem Count Fluorospheres 1046 1 Înregistrați valorile absolute ajustate celule µl din regiunile D din eprubetele TROL 45 34 7 AAD Exemplu Epru...

Page 110: ...ificați modul în care au fost stabilite limitele regiunii Dacă este necesar repetați prepararea cu eprubete de test noi Achiziționați și analizați atât noua cât și precedenta serie de eprubete Comparați cele două rezultate Dacă nu sunt în acord contactați reprezentantul local Beckman Coulter MĂRCI COMERCIALE Beckman Coulter logoul stilizat și mărcile de produse și servicii Beckman Coulter menționa...

Page 111: ... ar monoklonālu antivielu reaģentiem un 7 AAD dzīvotspējas krāsvielu bet pēc tam līzēts lai atdalītu eritrocītus Tiek pievienotas Stem Count vai Flow Count fluorosfēras lai tieši noteiktu absolūto skaitu Mērķa šūnu absolūtais skaits tiek noteikts iekrāsotajam un līzētajam preparātam veicot plūsmas citometrijas analīzi Paredzamos rezultātus nosaka paraugu analizēšanas nolūkam izmantojot Stem Kit re...

Page 112: ...var norādīt uz produkta noārdīšanos Ir jāizmeklē arī instrumenta standartizācija parauga sagatavošanas tehnika un antivielas veiktspēja Jebkuras izmaiņas Stem Trol kontroles šūnu fiziskajā izskatā normāls izskats ir bezkrāsains šķidrums vai jebkuras būtiskas izmaiņas absolūtā skaita izmaiņas 15 vērtībās kas iegūtas no atkārtotiem testiem izmantojot plūsmas citometrijas analīzi var liecināt par noā...

Page 113: ... 20 µl Stem Trol kontroles šūnas Samaisiet ar virpuļveida kustībām 5 sekundes 5 Inkubējiet istabas temperatūrā 18 25 C 20 minūtes sargājot no gaismas 6 Pievienojiet stobriņam 2 ml sagatavota 1X NH4Cl līzēšanas šķīduma un nekavējoties samaisiet ar virpuļveida kustībām 5 sekundes Plašāku informāciju par līzēšanas šķīduma sagatavošanu skatiet Stem Kit reaģentu lietošanas instrukcijā 7 Inkubējiet ista...

Page 114: ...uz priekšu vērstu izkliedi pret sānu izkliedi 7 Izveidojiet 7 histogrammu kā laiku pret FL3 Stem Count vai Flow Count fluorosfērām 8 Izveidojiet 8 histogrammu kā FL4 7 AAD pret sānu izkliedi 1 4 histogramma ir paredzēta lai raksturotu CD34 HPC procesu kurš var aizkavēties līdz analīzes darbībai Šīs pirmās četras histogrammas ir iestatītas saskaņā ar ISHAGE vadlīnijām par CD34 šūnu noteikšanu ar pl...

Page 115: ...8 8 histogramma piešķiriet 8 histogrammai apgabalu A lai rādītu CD45 notikumus Plūsmas citometra iestatīšana 1 Nodrošiniet ka plūsmas citometrs ir pareizi izlīdzināts un standartizēts gaismas izkliedei un fluorescences intensitātei atbilstoši ražotāja un laboratorijas pamatnostādnēm Pārbaudiet vai standarta darbībai ir iestatīta krāsu kompensācija Papildu norādījumus skatiet instrumenta rokasgrāma...

Page 116: ...troles šūnām pievieno 100 µl Stem Count fluorosfēru N 100 20 5 Normalizētais Stem Trol kontroles šūnu absolūtais skaits 248 x 5 1240 šūnas µl 3 Pārbaudiet Stem Trol kontroles šūnu absolūto skaitu kas iegūts salīdzinot ar Stem Trol kontroles šūnām Testētā koncentrācija šūnas µl kas norādīta uz flakona etiķetes Stem Trol kontroles šūnu absolūtais skaits nedrīkst pārsniegt 15 no Stem Trol kontroles š...

Page 117: ...B60231 AE 117 of 128 PAPILDINFORMĀCIJA www beckmancoulter com Simbolu skaidrojumi Simbolu vārdnīca ir pieejama vietnē beckman com techdocs dokumenta numurss B60062 ...

Page 118: ...ressar epítopos CD34 de classe III 2 e o antígeno comum de leucócitos CD45 em densidades que se aproximam das células hematopoiéticas humanas imaturas normais Uma mistura de células de controle Stem Trol adicionada em sangue total normal fresco primeiramente é corada com os reagentes de anticorpos monoclonais e o corante de viabilidade 7 AAD e posteriormente é lisada para remover os eritrócitos Fl...

Page 119: ...peratura ambiente 18 25 C antes do uso IMPORTANTE Há risco de resultados errados se houver vazamento das células de controle Stem Trol Uma vez abertas as células de controle Stem Trol devem ser armazenadas na posição vertical para evitar a possibilidade de vazamento Os reagentes não devem ser utilizados se forem observados sinais de vazamento Evidência de deterioração A incapacidade de obter resul...

Page 120: ... superior ou lateral do tubo de teste Tenha cuidado durante a pipetagem para evitar que o sangue toque o a parte superior ou a lateral do tubo de teste Limpe o tubo com um swab se necessário para remover todos os vestígios de amostras de sangue da parte superior ou lateral do tubo de teste 3 Na parte inferior do tubo pipete exatamente 100 µL de uma amostra de sangue total normal bem misturada usan...

Page 121: ...de de modificar os limites da região ao longo dos canais de Dispersão direta Fluorescência 1 e Fluorescência 2 Contudo como as características de dispersão lateral das células de controle Stem Trol são únicas você pode ajustar os limites da região ao longo da dispersão lateral As regiões A B C e D veja o título Criação de regiões para a definição da região devem ser modificadas para incluir o agru...

Page 122: ...8 Crie uma Região J retilínea no Histograma 8 para separar os leucócitos viáveis eventos negativos de 7 AAD de eventos não viáveis principalmente células de controle Stem Trol positivas para coloração com 7 AAD Criação de delimitações Crie delimitações da seguinte forma 1 Histograma 1 Atribua H ao Histograma 1 para exibir todos os eventos excluindo todas as fluoroesferas Stem Count ou Flow Count C...

Page 123: ...ecione Statistics Estatísticas CAL FACTOR Fator CAL 3 Insira o número do fator CAL concentração testada do frasco de fluoroesferas Stem Count ou Flow Count 4 Pressione ENTER 5 Selecione OKAY 6 No prompt digite Y para sim Quando são adquiridos pelo menos 1 000 singletos de fluoroesferas a contagem absoluta para as células de controle Stem Trol CD34 é ajustada automaticamente e pode ser obtida diret...

Page 124: ...es aceitos 1 173 1 587 1 380 207 células µL A contagem absoluta normalizada 1 240 células µL está dentro do intervalo IMPORTANTE Se a contagem absoluta das células de controle Stem Trol cair fora do intervalo de valores aceitos determine se a pipetagem foi realizada corretamente especialmente para as fluoroesferas Stem Count ou Flow Count e células de controle Stem Trol Verifique visualmente os re...

Page 125: ...ells Histogram 3 displays events from A and B Adjust Region C to include cells forming a cluster with characteristic CD34 Stem Trol Control Cells i e intermediate Side Scatter and low to intermediate CD45 staining It is the cluster of events that determines where Region C is centered Brightly FITC stained events platelet aggregates and mature monomyeloid cells must be excluded in the setting of th...

Page 126: ... Forward Scatter to ensure that even the smallest lymphocytes scatter above the discriminator Histogram 7 displays events from region H Region G encloses the fluorosphere singlet population only Check that the fluorosphere singlets accumulate homogeneously and constantly over time Label Region G as CAL to allow automatic calculation of absolute numbers of CD34 Stem Trol Control Cells Type the corr...

Page 127: ...ine NCCLS Document H42 A ISBN 1 56238 364 7 Vol 18 N 21 January 1999 Edition 2 Roth P Maples J Hall J Dailey T Use of control cells to standardize enumeration of CD34 stem cells 1996 Ann NY Acad Sci 770 370 372 3 Gratama J W Keeney M and Sutherland D R Enumeration of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Current Protocols in Cytometry 1999 6 4 1 6 4 22 B60231 AE 127 of 128 ...

Page 128: ...il Com e Imp de Prod de Lab Ltda Alameda Rio Negro 500 15 andar Torre B Alphaville Industrial CEP 06 454 00 Barueri São Paulo Brasil CNPJ 42 160 812 0001 44 Telefone 0800 771 8818 IMMUNOTECH S A S a Beckman Coulter Company 130 avenue de Lattre de Tassigny BP 177 13276 Marseille cedex 9 France 33 491 172 727 September 2019 B60231 AE 128 of 128 ...

Search results

Summary of Contents for IM3632

Reviews:

Related manuals for IM3632

Brands by name

Popular brands

Beckman Coulter IM3632, Manual

Search results

Summary of Contents for IM3632

Reviews:

Related manuals for IM3632

Brands by name

Popular brands