B60231–AE
93 of 128
3. Histogram 2 – Histogram 2 üzerinde düşük ila ara Yan Saçılmaya sahip tüm CD34
+
olaylarını içeren doğrusal
bir B Bölgesi oluşturun. Histogram 2’de 75.000 olaylık (CD45
+
olayları) bir durdurma sayısı ayarlayın.
4. Histogram 3 – Histogram 3 üzerinde kümelenmiş tüm CD45
dim
olaylarını içeren şekilsiz bir C Bölgesi oluşturun.
5. Histogram 4 – Histogram 4 üzerinde ara yan saçılma ve ara ila yüksek ileri saçılma ile tüm kümelenmiş olayları
içerecek şekilsiz bir D Bölgesi oluşturun.
6. Histogram 5 – Histogram 5 üzerinde CD34
+
olaylarındaki CD45 ekspresyonunun alt limitini doğrulamak üzere
bir Quadstat I Bölgesi oluşturun.
7. Histogram 5 – Histogram 5 üzerinde ikililer dahil tüm Stem-Count veya Flow-Count Fluorospheres’i çevreleyen
şekilsiz bir H Bölgesi oluşturun. H bölgesi, Histogram 5’in sağ üst köşesine konumlandırılmalıdır.
NOT:
H Bölgesinin ŞEKİLSİZ bir bölge olarak çizildiğinden emin olun.
8. Histogram 6 – D Bölgesini Histogram 4’ten F Bölgesi olarak Histogram 6’ya kopyalayın.
9. Histogram 7 – Histogram 7 üzerinde yalnızca Stem-Count veya Flow-Count Fluorospheres singletlerini içeren
doğrusal bir G Bölgesi oluşturun. G Bölgesi, CD34
+
HPC mutlak sayılarının otomatik hesaplanmasına izin
vermek üzere “CAL” olarak etiketlenebilir (daha fazla bilgi için cihaz kılavuzuna bakın).
10.Histogram 8 – Histogram 8 üzerinde uygulanabilir lökositleri (7- AAD negatif olayları) uygulanamaz olaylardan
(başta 7-AAD boyama için pozitif Stem-Trol Control Cells) ayırmak için doğrusal bir J Bölgesi oluşturun.
Kapı Oluşturma
Kapıları aşağıdaki şekilde oluşturun:
1. Histogram 1 – Histogram 1’e tüm Stem-Count veya Flow-Count Fluorospheres dışındaki bütün olayları
görüntülemek üzere “H” atayın. “not gates” oluşturma için cihaz kılavuzuna bakın. ”
2. Histogram 2 – Tüm CD45
+
olaylarını görüntülemek için Histogram 2’ye “A” atayın.
3. Histogram 3 – Tüm CD45
+
CD34
+
olaylarını görüntülemek için Histogram 3’e “A” ve “B” (AB) atayın.
4. Histogram 4 – Düşük ila ara yan saçılma ve düşük CD45 boyama ekspresyonuna sahip tüm CD45
+
CD34
+
kümelenmiş olaylarını görüntülemek için Histogram 4’e “A” ve “B” ve “C” (ABC) atayın. ABCD Bölgesindeki
olaylar gerçek CD34
+
HPC’dir.
5. Histogram 5 – Tüm olayları göstermek üzere geçitsizdir.
6. Histogram 6 – Ayrıştırıcı üzerinde görsel bir kontrol olarak lenfositleri görüntülemek için “E” atayın.
7. Histogram 7 – Histogram 7’ye ikililer dahil tüm Stem-Count veya Flow-Count Fluorospheres’i göstermek üzere
“H” atayın.
8. Histogram 8 – Histogram 8’e CD45
+
olaylarını göstermek üzere “A” atayın.
Akış Sitometresi Ayarı
1. Üretici ve laboratuvar kılavuzlarına uygun olarak akış sitometresinin doğru şekilde hizalandığından ve ışık
saçılması ve floresan yoğunluğu için standart hale getirildiğinden emin olun. Standart çalışma için renk
dengelemesinin ayarlandığını doğrulayın. Daha fazla talimat için cihazın kılavuzuna bakın.
2. Test tüplerini 5 saniye boyunca vorteksleyin.
3. Akış sitometresi üzerinde veri edinme gerçekleştirin. En az 75.000 CD45
+
olayı analiz edilmelidir.
4. TROL 45/34/7-AAD tüpünü analiz ederek ayrıştırıcıyı ve bölgeleri ayarlayın.
Analiz Örneği
EK’te gösterilen histogramlar protokolde gösterildikleri gibi artan sayı sırasıyla görüntülenir.
CD34
+
Stem-Trol Control Cells hesaplaması
Stem-Count veya Flow-Count Fluorospheres ile otomatik olarak ayarlanan akış sitometri sonuçları kullanılarak,
Assayed Concentration (Test Edilen Konsantrasyon) System II Yazılımı (Sürüm 3.0) ve bir COULTER EPICS
XL/XLMCL akış sitometresi ile elde edilmiştir.
COULTER EPICS XL / XL-MCL akış sitometrelerinde otomatik olarak hesaplanmış mutlak sayım belirlemelerini
almak için örnek edinme öncesinde doğru Stem-Count veya Flow-Count Fluorospheres Test Edilen
Konsantrasyonu girilmelidir.
