B60231–AE
49 of 128
3. Histogram 2 – Opret en retlinjet region B på histogram 2 for at medtage alle CD34
+
-hændelser med
lav til medium Side Scatter (sidelæns spredning).
Indstil tællingen til at stoppe ved 75.000 hændelser
(CD45
+
-hændelser) i histogram 2.
4. Histogram 3 – Opret en amorphous (amorf) region C på histogram 3 for at medtage alle samlede
CD45
dim
-hændelser.
5. Histogram 4 – Opret en amourphous (amorf) region D på histogram 4 for at medtage alle samlede hændelser
med medium side scatter (sidelæns spredning) og medium til høj forward scatter (forlæns spredning).
6. Histogram 5 – Opret et quadstat område I på histogram 5 for at verificere den nedre grænse for CD45-udtrykket
på CD34
+
-hændelser.
7. Histogram 5 – Opret en amorphous (amorf) region H på histogram 5 for at omkranse alle Stem-Count eller
Flow-Count Fluorospheres, inklusive dubletter. Region H bør være placeret i øverste højre hjørne af histogram
5.
BEMÆRK:
Sørg for, at region H tegnes som en AMORPHOUS (amorf) region.
8. Histogram 6 – Kopiér region D fra histogram 4 som region F i histogram 6.
9. Histogram 7 – Opret en retlinjet region G på histogram 7 for kun at medtage alle enkelte Stem-Count eller
Flow-Count Fluorospheres. Region G kan etiketteres som ”CAL” for at tillade automatisk cal-beregning af
absolutte tal for CD34
+
HPC (se vejledningen til instrumentet for yderligere oplysninger).
10.Histogram 8 – Opret en retlinjet region J på histogram 8 for at adskille brugbare leukocytter (7-AAD-negative
hændelser) fra ikke-brugbare hændelser (primært Stem-Trol Control Cells, der er positive for 7-AAD-farvning).
Oprettelse af gate
Opret gates på følgende måde:
1. Histogram 1 – Giv histogram 1 bogstavet ”H” for at vise alle hændelser undtagen alle Stem-Count eller
Flow-Count Fluorospheres. Se instruments brugervejledning om oprettelse af ”not gates”.
2. Histogram 2 – Tildel histogram 2 bogstavet ”A” for at vise alle CD45
+
-hændelser.
3. Histogram 3 – Tildel histogram 3 bogstavet ”A” og ”B” (AB) for at vise alle CD45
+
- CD34
+
-hændelser.
4. Histogram 4 – Tildel histogram 4 bogstaverne ”A”, ”B” og ”C” (ABC) for at vise alle CD45
+
CD34
+
-hændelser, der
er samlet som hændelser med lav til medium side scatter (sidelæns spredning) og lavt CD45-farvningsudtryk.
Hændelser fra område ABCD er faktiske CD34
+
HPC.
5. Histogram 5 – Ungated for at vise alle hændelser.
6. Histogram 6 – Tildel et ”E” for at vise lymfocytter som visuel kontrol på diskriminatoren.
7. Histogram 7 – Giv histogram 7 bogstavet ”H” for at vise alle Stem-Count Fluorospheres og Flow-Count
Fluorospheres, inklusive dubletter.
8. Histogram 8 – Giv histogram 8 bogstavet ”A” for at vise CD45
+
-hændelser.
Indstilling af flowcytometer
1. Sørg for,
at flowcytometeret er korrekt justeret og standardiseret med hensyn til lysspredning
og fluorescensintensiteten i henhold til producentens og laboratoriets retningslinjer.
Bekræft, at
farvekompensationen er indstillet til standardoperation.
Se instrumentets vejledning for yderligere
instruktioner.
2. Vortex-prøverør i 5 sekunder.
3. Udfør datahentning på flowcytometeret. Der skal analyseres mindst 75.000 CD45
+
-hændelser.
4. Tilpas diskriminatoren og områderne ved at analysere TROL 45/34/7-AAD-prøverøret.
Analyseeksempel
De histogrammer, der vises i TILLÆGGET, er vist i stigende rækkefølge som vist på protokollen.
Beregning af CD34
+
-Stem-Trol Control Cells
Brug
af
flowcytometerresultater
automatisk
justeret
med
Stem-Count
eller
Flow-Count
Fluorospheres analyseret koncentration opnået ved hjælp af System II-software (version 3.0) og et
COULTER EPICS XL/XLMCL-flowcytometer.
