B60231–AE
108 of 128
3. Histograma 2 – Creați o regiune B rectiliniară pe Histograma 2 pentru a include toate evenimentele CD34
+
cu
dispersie perpendiculară de la scăzută la intermediară. Setați un contor de oprire pentru 75.000 de evenimente
(evenimente CD45
+
) în Histograma 2.
4. Histograma 3 – Creați o regiune C amorfă în Histograma 3 pentru a include toate evenimentele CD45
dim
din cluster.
5. Histograma 4 – Creați o Regiune D amorfă în Histograma 4 pentru a include toate evenimentele din cluster cu
dispersie perpendiculară intermediară și dispersie pe direcția înainte intermediară până la ridicată.
6. Histograma 5 – Creați o regiune Quadstat I în Histograma 5 pentru a verifica limita inferioară a expresiei CD45 la
evenimentele CD34
+
.
7. Histograma 5 – Creați o regiune amorfă H în histograma 5 pentru a înconjura toate valorile Stem-Count sau
Flow-Count Fluorospheres, inclusiv dublurile. Regiunea H ar trebui să se găsească în colțul dreapta sus al Histogramei
5.
OBSERVAŢIE:
Asigurați-vă că Regiunea H este trasată ca regiune AMORPHOUS (Amorfă).
8. Histograma 6 – Copiați regiunea D din Histograma 4 ca Regiune F în Histograma 6.
9. Histograma 7 – Creați o regiune G rectiliniară în Histograma 7 pentru a include numai valorile identice pentru
Stem-Count sau Flow-Count Fluorospheres. Regiunea G poate fi etichetată drept „CAL” pentru a permite calcularea
automată a numerelor absolute de CD34
+
HPC (consultați manualul instrumentului pentru detalii suplimentare).
10. Histograma 8 – Creați o regiune rectiliniară J în Histograma 8 pentru a separa leucocitele viabile (evenimente 7-AAD
negative) de evenimentele neviabile (în special celule pozitive Stem-Trol Control Cells pentru colorarea 7-AAD).
Crearea porții
Creați porțile astfel:
1. Histograma 1 – Atribuiți valoarea „H” histogramei 1 pentru a afișa toate evenimentele, mai puțin toate valorile
Stem-Count sau Flow-Count Fluorospheres, inclusiv dublurile. Consultați manualul instrumentului pentru a vedea
cum se creează regiunile „not gates ”.
2. Histograma 2 – Atribuiți valoarea „A” Histogramei 2 pentru a afișa toate evenimentele CD45
+
.
3. Histograma 3 – Atribuiți valorile „A” și „B” (AB) Histogramei 3 pentru a afișa toate evenimentele CD45
+
CD34
+
.
4. Histograma 4 – Atribuiți valorile „A”, „B” și „C” (ABC) Histogramei 4 pentru a afișa toate evenimentele CD45
+
CD34
+
din cluster cu dispersie perpendiculară de la scăzută la intermediară și colorare CD45 scăzută. Evenimentele din
Regiunea ABCD reprezintă CD34
+
HPC reale.
5. Histograma 5 – Anulați porțile pentru a afișa toate evenimentele.
6. Histograma 6 – Atribuiți valoarea „E” pentru a afișa limfocitele ca verificare vizuală la discriminator.
7. Histograma 7 – Atribuiți valoarea „H” histogramei 7 pentru a afișa toate valorile Stem-Count sau Flow-Count
Fluorospheres, inclusiv dublurile.
8. Histograma 8 – Atribuiți valoarea „A” histogramei 8 pentru a afișa toate evenimentele CD45
+
.
Configurarea citometrului de flux
1. Asigurați-vă că sistemul de citometrie de flux este corect aliniat și standardizat pentru dispersia luminii și
intensitatea de fluorescență, conform instrucțiunilor producătorului și laboratorului. Verificați compensarea culorii:
aceasta trebuie să fie configurată pentru operare standard. Consultați manualul instrumentului pentru instrucțiuni
suplimentare.
2. Omogenizați eprubetele de test timp de 5 secunde.
3. Realizați achiziția datelor pe citometrul de flux. Trebuie analizate minimum 75.000 de evenimente CD45
+
.
4. Ajustați discriminatorul și regiunile analizând eprubeta TROL 45/34/7-AAD.
Exemplu de analiză
Histogramele prezentate în ANEXĂ sunt afișate în ordine crescătoare, așa cum sunt afișate în protocol.
Calcularea numărului de CD34
+
Stem-Trol Control Cells
Utilizarea rezultatelor citometrului de flux ajustate automate cu concentrația de test pentru Stem-Count sau Flow-Count
Fluorospheres obținută utilizând software-ul System II (versiunea 3.0) și un citometru de flux COULTER EPICS XL/XLMCL.
Pentru a obține determinări de numere absolute calculate automat la citometrele de flux COULTER EPICS XL / XL-MCL,
trebuie să introduceți valoarea corectă pentru concentrația testată de Stem-Count sau Flow-Count Fluorospheres înainte
de solicitarea probelor.
