B60231–AE
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Criação de regiões
Crie regiões da seguinte forma:
1. Histograma 1 — Crie uma Região A retilínea para incluir todos os leucócitos CD45
+
e eliminar plaquetas,
detritos de hemácias e agregados.
2. Histograma 1 — Crie uma Região E amorfa nos linfócitos (CD45 brilhante, dispersão lateral baixa).
3. Histograma 2 — Crie uma Região B retilínea no Histograma 2 para incluir todos os eventos CD34
+
com
dispersão lateral baixa à intermediária. Defina uma contagem de parada de 75.000 eventos (eventos CD45
+
)
no Histograma 2.
4. Histograma 3 — Crie uma Região C amorfa no Histograma 3 para incluir todos os eventos CD45
dim
(difusos)
agrupados.
5. Histograma 4 — Crie uma Região D amorfa no Histograma 4 para incluir todos os eventos agrupados com
dispersão lateral intermediária e dispersão frontal intermediária à alta.
6. Histograma 5 — Crie uma Região I Quadstat no Histograma 5 para verificar o limite inferior da expressão de
CD45 nos eventos CD34
+
.
7. Histograma 5 — Crie uma Região H amorfa no Histograma 5 para cercar todas as fluoroesferas Stem-Count
ou Flow-Count, incluindo duplicadas. A região H deve estar localizada no canto superior direito do Histograma
5.
OBSERVAÇÃO: Certifique-se que a Região H está desenhada como uma região AMORFA.
8. Histograma 6 — Copie a Região D do Histograma 4 como a Região F no Histograma 6.
9. Histograma 7 — Crie uma Região G retilínea no Histograma 7 para incluir apenas os singletos das
fluoroesferas Stem-Count ou Flow-Count. A Região G pode ser rotulada como “CAL” para permitir o cálculo
automático dos números absolutos de HPC CD34
+
(consulte o manual do instrumento para obter mais
detalhes).
10.Histograma 8 — Crie uma Região J retilínea no Histograma 8 para separar os leucócitos viáveis (eventos
negativos de 7-AAD) de eventos não viáveis (principalmente células de controle Stem-Trol positivas para
coloração com 7-AAD).
Criação de delimitações
Crie delimitações da seguinte forma:
1. Histograma 1 — Atribua “H” ao Histograma 1 para exibir todos os eventos, excluindo todas as fluoroesferas
Stem-Count ou Flow-Count. Consulte o manual do instrumento para a criação de “sem delimitações”. ”
2. Histograma 2 — Atribua “A” ao Histograma 2 para exibir todos os eventos CD45
+
.
3. Histograma 3 — Atribua “A” e “B” (AB) ao Histograma 3 para exibir todos os eventos CD45
+
e CD34
+
.
4. Histograma 4 — Atribua “A” e “B” e “C” (ABC) ao Histograma 4 para exibir todos os eventos agrupados de
eventos CD45
+
CD34
+
com dispersão lateral baixa a intermediária e baixa expressão de coloração CD45. Os
eventos da Região ABCD são HPC CD34
+
verdadeiros.
5. Histograma 5 — Não delimitado, para mostrar todos os eventos.
6. Histograma 6 — Atribua “E” para exibir linfócitos como uma verificação visual no discriminador.
7. Histograma 7 — Atribua “H” ao Histograma 7 para exibir todas as fluoroesferas Stem-Count ou Flow-Count,
incluindo duplicadas.
8. Histograma 8 — Atribua “A” ao Histograma 8 para exibir os eventos CD45
+
.
Configuração do citômetro de fluxo
1. Garanta que o citômetro de fluxo está devidamente alinhado e padronizado para a intensidade de
fluorescência e dispersão de luz de acordo com as orientações do fabricante e do laboratório. Verifique
se a compensação de cor está ajustada para operação padrão. Consulte o manual do instrumento para
instruções adicionais.
2. Coloque os tubos de teste no vórtex por 5 segundos.
3. Execute a aquisição de dados no citômetro de fluxo. Um mínimo de 75.000 eventos CD45
+
devem ser
analisados.
4. Ajuste o discriminador e as regiões através da análise do tubo TROL 45/34/7-AAD.
