B60231–AE
91 of 128
PROSEDÜR
Otomatik analiz ile ilgili talimatların tamamı için stemCXP Sistem Yazılımı ile birlikte verilen stemCXP System
Guide’a (stemCXP Sistem Kılavuzu) bakın.
Manuel analiz için Stem-Kit Reagents prospektüsüne ve aşağıdaki prosedüre bakın.
NOT:
Analizi standart hale getirmek için yeni Stem-Kit Reagents alırken ve sonrasında günlük
aralıklarla, sağlıklı bir donörün normal periferik kan örneği ile Stem-Trol Control Cells’i
boyayarak işlem kontrolü gerçekleştirin. Ayrıca, Stem-Trol Control Cells stabilize hücreler
(uygulanamaz hücreler) olduğundan, 7-AAD Viability Dye boyaması Stem-Trol Control
Cells üzerinde görsel olarak kontrol edilebilir (Histogram Oluşturma başlığına bakın).
Üretici ve laboratuvar kılavuzlarına uygun olarak akış sitometresinin doğru şekilde hizalandığından ve floresan
yoğunluğu için standart hale getirildiğinden emin olun. Floresan dengeleme ayarlarının üretici ve laboratuvar
kılavuzlarına uygun olarak düzenlendiğinden emin olun.
Kontrol reaktifini ve antikorları oda sıcaklığına getirin.
Her deneyde bir tüpü etiketleyin: TROL 45/34/7-AAD.
1. Tüpe 20 µL CD45-FITC / CD34-PE pipetleyin.
2. Tüpün içine 20 µL 7-AAD Viability Dye pipetleyin.
ÖNEMLİ:
Kan numunesi test tüpünün üstünde veya yanında kalırsa eksik parçalama riski oluşur.
Kanın test tüpünün üst veya yan kısmına temas etmesini engellemek için pipetleme
sırasında dikkatli olun. Gerekirse, tüpü pamuklu bir çubukla temizleyerek test tüpünün
üst veya yan kısmında kalan tüm kan numunesi izlerini ortadan kaldırın.
3. Kalibre edilmiş pozitif kaydırma veya tekrarlama pipeti kullanarak, tüpün dibine 100 µL iyi karıştırılmış normal
tam kan örneğini pipetleyin.
4. Stem-Trol’ü hazırlayıp ekleyin:
•
Stem-Trol Control Cells’i 5 saniye boyunca vorteksleyin.
•
Tüpün içine 20 µL Stem-Trol Control Cells pipetleyin.
•
Tüpleri 5 saniye boyunca vorteksleyin.
5. Oda sıcaklığında (18-25°C) ışıktan koruyarak 20 dakika boyunca inkübe edin.
6. Tüpe 2 mL hazırlanmış 1X NH
4
Cl Lysing Solution ekleyin ve vakit geçirmeden 5 boyunca vorteksleyin.
Parçalama Çözeltisini hazırlamaya ilişkin ayrıntılar için Stem-Kit Reagents prospektüsüne bakın.
7. Oda sıcaklığında ışıktan koruyarak 10 dakika boyunca inkübe edin.
8. Tüpleri buz üzerine yerleştirilmiş (2-8°C) ve ışıktan korunan bir rafta saklayın.
ÖNEMLİ:
Hava kabarcıkları pipetlenirse hata sonuç riski oluşabilir. Stem-Count veya Flow-Count
Fluorospheres’in gereğinden fazla karıştırılması hava kabarcıkları oluşturabilir.
Stem-Count veya Flow-Count Fluorospheres’i gereğinden fazla karıştırmayın ve örnek
tüplerine hava kabarcıkları pipetlemeyin.
9. Kullanmadan önce şişeyi 3 ila 5 kez ters çevirerek Stem-Count veya Flow-Count Fluorospheres’i hafifçe
karıştırın. Hava kabarcığı oluşumunu en aza indirmek için aşırı karıştırmadan kaçının.
10.Edinme öncesinde tüpe 100 µL Stem-Count veya Flow-Count Fluorospheres pipetleyin.
11. Her ekleme sonrasında vakit geçirmeden 5 saniye boyunca vorteksleyin. 2-8°C’de saklayın. Akış sitometrik
ediniminden hemen önce vortekslemeyi tekrarlayın.
ÖNEMLİ:
Stem-Count veya Flow-Count Fluorospheres eklendikten sonra örnek 1 saatten uzun
süre analiz edilirse hatalı sonuç riski. Hazırlanan örnekler Stem-Count veya Flow-Count
Fluorospheres’in eklenmesinden sonraki 1 saat içinde analiz edilmelidir.
