B60231–AE
107 of 128
Sumarul preparării (etichetă eprubetă: TROL45/34/7-AAD)
Reactivi și probe
Volum
CD45-FITC / CD34-PE
20 µl
Colorant viabilitate 7-AAD
20 µl
Sânge integral
100 µl
Stem-Trol Control Cells
20 µl
Vortex – Incubați la temperatura camerei timp de 20 minute. A se feri de lumină
1X NH
4
Cl Lysing Solution
2 ml
Vortex – Incubați la temperatura camerei timp de 10 minute. A se feri de lumină
Stem-Count Fluorospheres
100 µl
POARTA MANUALĂ ȘI METODA DE ANALIZĂ
Configurarea protocolului
Citometrul de flux trebuie să fie echipat pentru a detecta dispersie perpendiculară, dispersia pe direcția înainte și patru
canale de fluorescență. Pentru canalul FL3 (pentru monitorizarea Stem-Count sau Flow-Count Fluorospheres), folosiți un
filtru de trecere bandă de 620 nm. Pentru canalul FL4 (pentru monitorizarea colorantului de viabilitate 7-AAD), folosiți
un filtru de trecere cu lungimea de 675 nm.
OBSERVAŢIE:
Aceeași schemă și aceleași serii de porți pentru 8 histograme precum cele declarate pentru
analiza specimenelor trebuie să fie respectată pentru Stem-Trol Control Cells. Deoarece
Stem-Trol Control Cells au dimensiuni apropiate și exprimă antigenii CD45 și CD34 la densități
asemănătoare celulelor normale imature hematopoietice, nu este nevoie să modificați
limitele regiunii pentru canalele Forward Scatter (Dispersie pe direcția înainte), Fluorescență 1
și Fluorescență 2. Însă caracteristicile pentru Stem-Trol Control Cells Side Scatter (Dispersie
perpendiculară) sunt unice și este posibil să fie nevoie să ajustați limitele regiunii pentru
Side Scatter (Dispersie perpendiculară). Regiunile A, B, C și D (consultați secțiunea Crearea
regiunii pentru definirea regiunii) trebuie să fie modificate pentru a include clusterul de
caracteristici Stem-Trol Control Cells.
Crearea histogramei
Creați histogramele astfel:
1. Creați Histograma 1 ca FL1 CD45-FITC vs Side Scatter (Dispersie perpendiculară).
2. Creați Histograma 2 ca FL2 CD34-PE vs Side Scatter (Dispersie perpendiculară).
3. Creați Histograma 3 ca FL1 CD45-FITC vs Side Scatter (Dispersie perpendiculară).
4. Creați Histograma 4 ca Forward Scatter (Dispersie pe direcția înainte) vs Side Scatter (Dispersie perpendiculară).
5. Creați Histograma 5 ca FL1 CD45-FITC vs FL2 CD34-PE.
6. Creați Histograma 6 ca Forward Scatter (Dispersie pe direcția înainte) vs Side Scatter (Dispersie perpendiculară).
7. Creați Histograma 7 ca Timp vs FL3 Stem-Count sau Flow-Count Fluorospheres.
8. Creați Histograma 8 ca FL4 7-AAD vs Side Scatter (Dispersie perpendiculară).
Histogramele de la 1 la 4 sunt destinate caracterizări CD34
+
HPC, un proces care poate fi întârziat până la etapa respectivă
din analiză. Aceste patru prime histograme sunt configurate conform Instrucțiunilor ISHAGE pentru determinarea celulelor
CD34
+
prin citometrie de flux (2,3).
Histogramele 5 până la 7 sunt destinate monitorizării parametrilor importanți în etapa de achiziție. Aceștia includ
discriminatorul Forward Scatter (Dispersie pe direcția înainte), numărul de evenimente CD45
+
care trebuie colectate și
acumularea valorilor unice corecte de fluorosfere.
Histograma 8 este destinată diferențierii și analizării evenimentelor viabile de cele neviabile, când este necesar.
Crearea regiunii
Creați regiunile astfel:
1. Histograma 1 – Creați o regiune A rectiliniară pentru a include toate leucocitele CD45
+
și eliminați trombocitele,
resturile de eritrocite și agregatele.
2. Histograma 1 – Creați o regiune amorfă E pentru limfocite (CD45 luminos, dispersie perpendiculară scăzută).
