B60231–AE
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Die Histogramme 1 bis 4 dienen der Charakterisierung von CD34
+
-HPC. Dieser Prozess kann bis zum
Analyseschritt verzögert werden. Diese ersten vier Histogramme werden gemäß den ISHAGE-Richtlinien für die
CD34
+
-Zellbestimmung durch die Durchflusszytometrie aufgestellt (2,3).
Die Histogramme 5 bis 7 sind zur Überwachung der Parameter gedacht, die während der Probenentnahme wichtig
sind. Dazu gehören der „Forward Scatter“-Diskriminator (für die Vorwärtsstreuung), die Anzahl der zu sammelnden
CD45
+
-Ereignisse und die richtige Akkumulation von Fluorosphere-Singuletten.
Das Histogramm 8 dient zum Analysieren und Unterscheiden lebensfähiger Ereignisse von nicht lebensfähigen
Ereignissen, falls erforderlich.
Festlegen der Regionen
Folgende Regionen anlegen:
1. Histogramm 1 – Eine geradlinige Region A erstellen, um alle CD45
+
-Leukozyten einzuschließen und
Blutplättchen, abgelagerte Erythrozyten und Ansammlungen zu beseitigen.
2. Histogramm 1 – Amorphe Region E für die Lymphozyten erstellen (helles CD45, niedrige seitliche Streuung).
3. Histogramm 2 – Eine geradlinige Region B für Histogramm 2 erstellen, um alle CD34
+
-Ereignisse mit niedriger
bis mittlerer „Side Scatter“ (seitlicher Streuung) einzuschließen.
Eine Endzahl von 75 000 Ereignissen
(CD45
+
-Ereignissen) in Histogramm 2 festlegen.
4. Histogramm 3 – Eine amorphe Region C für Histogramm 3 zum Einschließen aller clusterförmigen
CD45
dim
-Ereignisse erstellen.
5. Histogramm 4 – Eine amorphe Region D für Histogramm 4 erstellen, um alle Cluster-Ereignisse mit mittlerer
seitlicher Streuung und mittlerer bis hoher Vorwärtsstreuung einzuschließen.
6. Histogramm 5 – Quadstat-Region I für Histogramm 5 erstellen, um die Untergrenze des CD45-Ausdrucks für
CD34
+
-Ereignisse zu überprüfen.
7. Histogramm 5 – Eine amorphe Region H für Histogramm 5 erstellen, um alle Stem-Count oder Flow-Count
Fluorospheres, einschließlich Dubletten, einzuschließen. Region H muss sich in der rechten oberen Ecke
von Histogramm 5 befinden.
ANMERKUNG:
Sicherstellen, dass Region H als Region vom Typ AMORPHOUS (amorph) gezeichnet
wird.
8. Histogramm 6 – Region D aus Histogramm 4 als Region F in Histogramm 6 kopieren.
9. Histogramm 7 – Eine geradlinige Region G für Histogramm 7 erstellen, um nur alle Singuletten von
Stem-Count oder Flow-Count Fluorospheres einzuschließen.
Region G kann mit „CAL“ (Berechnung)
beschriftet werden, um die automatische Berechnung der Absolutzahlen von CD34
+
-HPC zu ermöglichen
(weitere Informationen finden Sie im Instrumentenhandbuch).
10.Histogramm 8 – Eine geradlinige Region J für Histogramm 8 erstellen, um lebensfähige Leukozyten (7-AAD
negative Ereignisse) von nicht lebensfähigen Ereignissen (hauptsächlich positive Werte bei Stem-Trol Control
Cells für 7-AAD Verfärbung) zu trennen.
Definieren der Gates
Folgende Gates anlegen:
1. Histogramm 1 – Histogramm 1 den Buchstaben „H“ zuweisen, um alle Ereignisse außer Stem-Count oder
Flow-Count Fluorospheres anzuzeigen.
Weitere Informationen zum Erstellen von „not gates“ (anderer
Elemente als Gates) finden Sie im Instrumentenhandbuch .
2. Histogramm 2 – „A“ zu Histogramm 2 zuweisen, um alle CD45
+
-Ereignisse anzuzeigen.
3. Histogramm 3 – „A“ und „B“ (AB) zu Histogramm 3 zuweisen, um alle CD45
+
-CD34
+
-Ereignisse anzuzeigen.
4. Histogramm 4 – „A“ und „B“ und „C“ (ABC) zum Histogramm 4 hinzufügen, um alle CD45
+
- und
CD34
+
-Clusterereignisse mit niedriger bis mittlerer „Side Scatter“ (seitlicher Streuung) und geringem
CD45-Verfärbungsausdruck anzuzeigen. Ereignisse aus Region ABCD sind echte CD34
+
-HPC.
5. Histogramm 5 – Kein Gate, damit alle Ereignisse angezeigt werden.
6. Histogramm 6 – „E“ zuweisen, um Lymphozyten als visuelle Prüfung im Diskriminator anzuzeigen.
7. Histogramm 7 – „H“ zu Histogramm 7 zuweisen, um alle Stem-Count oder Flow-Count Fluorospheres,
einschließlich Dubletten, anzuzeigen.
