B60231–AE
98 of 128
•
Stem-Kit Reagents (REF IM3630), в том числе краситель жизнеспособности 7-AAD.
•
Альтернатива Stem-Count Fluorospheres: Flow-Count Fluorospheres (REF. 7547053)
•
Ледяная ванна.
•
Пластиковые пробирки (12 x 75 мм).
•
Калиброванная пипетка прямого вытеснения (20 мкл, 100 мкл, 2 мл) и наконечники или калиброванная
репитер-пипетка (20 мкл, 100 мкл, 2 мл) и наконечники.
•
Калиброванные стандартные пипетки (20 мкл, 100 мкл, 2 мл) и наконечники.
•
Мешалка типа Вортекс (вихревой смеситель).
•
Таймер.
•
Проточный цитометр.
•
Программное обеспечение системы stemCXP ТОЛЬКО для автоматизированного анализа контрольных
клеток Stem-Trol Control Cells на проточных цитометрах FC 500 с программным обеспечением CXP.
ПРОЦЕДУРА
Для получения полных инструкций по автоматическому анализу см. stemCXP System Guide (Руководство
по системе stemCXP), которое прилагается к программному обеспечению системы stemCXP и содержит
полные инструкции.
Чтобы провести анализ вручную, см. вкладыш в упаковку Stem-Kit Reagents и следующую процедуру.
ЗАМЕЧАНИЕ:
Для стандартизации анализа выполняйте проверку процесса путем окрашивания
контрольных клеток Stem-Trol Control Cells с пробой нормальной периферической
крови от здорового донора при получении новых реагентов Stem-Kit Reagents и
затем ежедневно. Кроме того, так как контрольные клетки Stem-Trol Control Cells
являются стабилизированными клетками (т. е. нежизнеспособными клетками),
можно визуально проверить окрашивание красителем жизнеспособности 7-AAD
на контрольных клетках Stem-Trol Control Cells (см. заголовок «Создание
гистограммы»).
Убедитесь, что проточный цитометр надлежащим образом отрегулирован и стандартизирован на
интенсивность флуоресценции в соответствии с рекомендациями производителя и лаборатории.
Убедитесь, что настройки компенсации флуоресценции надлежащим образом скорректированы в
соответствии с рекомендациями производителя и лаборатории.
Доведите контрольный реагент и антитела до комнатной температуры.
Для каждого эксперимента пометьте одну пробирку: TROL 45/34/7-AAD.
1. Пипетируйте 20 мкл CD45-FITC / CD34-PE в пробирку.
2. Добавьте в пробирку пипеткой 20 мкл красителя жизнеспособности 7-AAD.
ВАЖНО:
Риск неполного лизиса, если образец крови остается в верхней части или на
боковой стороне тестовой пробирки. Выполняйте пипетирование с осторожностью,
чтобы избежать попадания крови на верхнюю или боковую часть тестовой
пробирки. Очистите пробирку ватным шариком, если требуется, чтобы удалить все
следы образца крови с верхней или боковой части тестовой пробирки.
3. На дно пробирки осторожно перенесите пипеткой 100 мкл хорошо перемешанной пробы цельной крови,
используя калиброванную пипетку прямого вытеснения или репитер-пипетку.
4. Приготовьте и добавьте Stem-Trol:
•
Обработайте на вортексе контрольные клетки Stem-Trol Control Cells в течение 5 секунд.
•
Осторожно перенесите пипеткой 20 мкл контрольных клеток Stem-Trol Control Cells в пробирку.
•
Обработайте пробирки на вортексе в течение 5 секунд.
5. Инкубируйте при комнатной температуре (18–25°C) в течение 20 мин, в защищенном от света месте.
6. Добавьте 2 мл приготовленного лизирующего раствора 1X NH
4
Cl Lysing Solution в пробирку и
незамедлительно обработайте на вортексе в течение 5 секунд.
Сведения о приготовлении лизирующего раствора см. на вкладыше в упаковку Stem-Kit Reagents.
