Merck Millipore Auto2D Plus, Быстрый старт

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Preparazione
Reagenti
1. Preparare e conservare i kit di reagenti
come indicato nella documentazione
fornita o nel manuale d’uso completo
(online).
2. Lasciare che i seguenti prodotti,
conservati a basse temperature,
raggiungano la temperatura ambiente
(tenere a 20–25 °C per circa 10 minuti).
• Chip IEF
• Chip PAGE
• Soluzione di reidratazione
• Soluzione di DTT
• Anfolita
3. Preparare la soluzione di reidratazione
alla concentrazione di lavoro per
la reidratazione del Chip IEF e per
l’estrazione/diluizione del campione
di proteine:
Reagenti Volume
Concentrazione
finale
Soluzione di
reidratazione
189 µL
Soluzione di
DTT (1M)
10 µL 50 mM
Anfolita* 1–2 µL 0,5–1% v/v
Totale 200 µL
* scegliere l’anfolita appropriato in base
all’intervallo di pH del Chip IEF Per
anfoliti alla concentrazione stock del
40%, aggiungere 1 µL. Per gli anfoliti
alla concentrazione 100X, aggiungere
2 µL.
4. Preparare il tampone di equilibrazione alla
concentrazione di lavoro per equilibrare
le proteine separate mediante IEF, prima
dell’SDS-PAGE.
Reagenti Volume
Concentrazione
finale
Premix di
tampone di
equilibrazione
760 µL
Soluzione di
DTT (1M)
40 µL 50 mM
Totale 800 µL
Preparazione dei campioni
Aggiungere il campione di proteine alla
soluzione di reidratazione alla concentrazione
di lavoro preparata come descritto al
punto 3. Il campione può essere diluito
2 volte o più con tale soluzione, fino a
raggiungere la concentrazione proteica
desiderata e la concentrazione salina adeguata.
Un’eccessiva concentrazione di sale potrebbe
compromettere la separazione delle proteine
durante la focalizzazione isoelettrica o
causare un aumento della corrente a valori
superiori ai 100 µA. I campioni con un’elevata
concentrazione salina devono essere
desalinizzati mediante una delle seguenti
metodiche:
Precipitazione con TCA/acetone seguita da
risospensione nella soluzione di reidratazione
alla concentrazione di lavoro
OPPURE
Scambio di tampone su colonnina
da centrifuga
OPPURE
Protocollo di desalinizzazione del dispositivo
Auto2D
®
(per ulteriori informazioni,
consultare il manuale d’uso completo
online.)
NOTA: durante la risospensione delle proteine,
evitare di riscaldarle oltre i 37 °C.
Quantificare le proteine. Nell’elettroforesi 2D è
possibile caricare da 0,1 a 100 µg di proteine.
La quantità ottimale dipende dal metodo di
rilevamento e dalla complessità del campione.
Come punto di partenza si consiglia di usare
le seguenti quantità di proteine; gli utenti
potrebbero dover ottimizzare la quantità da
caricare in relazione al loro campione specifico.
• Colorazione con blu di Coomassie: 50 µg
• Colorazione fluorescente: 10 µg
• Colorazione argentica: 5 µg
• Pre-marcatura fluorescente 3 µg
In base al quantitativo di proteine caricate nel
Chip Soluzioni, per la separazione utilizzare il
metodo S, M o L.
Il volume di campione da caricare nel
dispositivo è di 13–15 µL. Se necessario, il
campione può essere diluito con la soluzione di
reidratazione alla concentrazione di lavoro.
Alimentazione del dispositivo
Auto2D
®
Scegliere il cavo di alimentazione (fornito
con il dispositivo) compatibile con le prese di
corrente del proprio paese. Inserire nella parte
posteriore del dispositivo Auto2D
®
la spina
corrispondente del cavo e l’altra nella presa
di corrente.
L’interruttore si trova accanto alla porta della
spina CA posta sul retro dell’apparato Auto2D
®
Premere l’interruttore verso l’alto
per accendere.
L’applicazione si avvierà in automatico.
Sullo schermo, selezionare la modalità
Auto2D
®
Plus.
Impostazione del metodo (recipe)
Selezionare SETTING > RECIPE. Toccare la
schermata Recipe Information. Apparirà la
finestra di dialogo per la selezione del metodo.
Selezionare il nome del metodo > LOAD >
OK > EXIT.
Nota: Verificare che il nome del metodo
desiderato sia visualizzato nella parte superiore
destra dello schermo.
Assemblaggio del Chip
Chip PAGE
Lato del catodo
Lato dell’anodo
1. Rimuovere il nastro bianco sul lato
dell’anodo del Chip.
2. Rimuovere con attenzione la copertura
di plastica sul lato del catodo del Chip.
3. Sciacquare delicatamente con acqua
distillata i pozzetti per il tampone
dell’anodo e del catodo. Utilizzando una
salviettina di carta, asciugare la parte
superiore del Chip stando attenti a non
danneggiare la sottile striscia di gel
situata sul lato del catodo.
Inserire i Chip nel vassoio
Sul touchscreen del dispositivo Auto2D
®
selezionare OPEN > OK. Apertosi il vassoio,
posizionare il Chip PAGE (linea azzurra) con
la parte dell’anodo posta anteriormente.
Posizionare il Chip Soluzioni Plus (linee blu
scuro) sopra al Chip PAGE, orientandolo con gli
angoli tagliati in posizione anteriore.