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20424816 Rev 06/21
20424816 Rev 06/21
French
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Préparation
Réactifs
1. Préparer et conserver les kits de réactifs
comme indiqué dans la documentation
fournie avec les kits ou dans le manuel
d’utilisation complet (en ligne).
2. Les produits suivants, conservés à
basse température, doivent reposer
à température ambiante (20–25 °C)
pendant environ 10 minutes.
• Puce IEF
• Puce PAGE
• Solution de réhydratation
• Solution de DTT
• Ampholyte
3. Préparer la solution de réhydratation de
travail, qui sera utilisée pour réhydrater
la Puce IEF et extraire/diluer l’échantillon
protéique:
Réactifs
Volume
Concentration
finale
Solution de
réhydratation
189 µl
Solution de
DTT (1 M)
10 µl
50 mM
Ampholyte*
1–2 μl
0,5–1 % v/v
Total
200 µl
* Sélectionner l’ampholyte selon la plage
de pH de la Puce IEF utilisée. Dans le cas
des ampholytes à une concentration mère
de 40 %, ajouter 1 µl. Dans le cas des
ampholytes concentrés 100X, ajouter 2 µl.
4. Préparer le tampon d’équilibration de
travail, qui sera utilisé pour équilibrer
les protéines séparées par IEF avant la
séparation par SDS-PAGE.
Réactifs
Volume
Concentration
finale
Pré-mélange
de tampon
d'équilibration
760 µl
Solution de
DTT (1 M)
40 µl
50 mM
Total
800 µl
Préparation de l’échantillon
Dissoudre l’échantillon protéique dans la
solution de réhydratation de travail préparée
selon l’étape 3. L’échantillon peut être dilué
d’un facteur 2 ou plus avec la solution de
réhydratation de travail pour obtenir la
concentration souhaitée en protéines et réduire
la concentration en sels.
Une concentration élevée en sels peut
perturber la séparation des protéines lors de
la focalisation isoélectrique et entraîner une
hausse du courant au-delà de 100 µA. Les
échantillons présentant une concentration
élevée en sels peuvent être dessalés par l’une
des méthodes suivantes:
Précipitation à l’acide trichloracétique
(TCA)/acétone et remise en suspension
des protéines dans la solution de
réhydratation de travail
OU
Échange de tampons à l’aide d’une colonne
à centrifuger
OU
Protocole de dessalage sur l’appareil
Auto2D
®
(voir le manuel d’utilisation complet
en ligne pour plus d’informations)
REMARQUE:
Lors de la remise en suspension
des protéines, éviter de les chauffer à une
température supérieure à 37 °C.
Quantifier les protéines. Charger entre 0,1 et
100 µg de protéines pour l’électrophorèse 2D.
La quantité optimale de protéines dépend de
la méthode de détection et de la complexité
de l’échantillon. Les quantités suivantes de
protéines doivent être utilisées comme point
de départ. Il est possible que les utilisateurs
doivent optimiser la quantité de protéines
chargées pour leur échantillon particulier.
• Coloration au bleu brillant de Coomassie:
50 µg
• Marquage fluorescent: 10 µg
• Coloration à l’argent: 5 µg
• Pré-marquage fluorescent: 3 µg
Se baser sur la quantité de protéines chargée
sur la Puce de solutions pour déterminer s’il
convient d’utiliser la recette de type S, M ou L
pour la séparation des protéines.
Le volume d’échantillon appliqué à l’appareil
est compris entre 13 et 15 µl. L’échantillon
peut être dilué avec la solution de
réhydratation de travail, si nécessaire.
Mise en marche de l’appareil
Auto2D
®
Sélectionner le cordon d’alimentation (fourni
avec le dispositif) compatible avec les prises
secteur de votre pays. Brancher fermement une
extrémité du cordon à la prise correspondante
à l’arrière de l’appareil Auto2D
®
et l’autre
extrémité à une prise secteur.
L’interrupteur de mise en marche se trouve
près de la prise du cordon d’alimentation,
à l’arrière de l’appareil Auto2D
®
. Appuyer
sur l’interrupteur vers le haut pour mettre
l’appareil en marche.
L’application sera automatiquement lancée. Sur
l’écran, sélectionner le mode Auto2D
®
Plus.
Chargement d’une recette
Sélectionner SETTING (Réglages) > RECIPE
(Recette). Toucher l’écran Recipe Information
(Informations sur les recettes). Une boîte de
dialogue pour sélectionner la recette s’affiche.
Sélectionner
RECIPE NAME (Nom de la recette) >
LOAD (Charger) > OK > EXIT (Quitter).
Remarque:
vérifier que le nom de la recette
souhaitée est affiché en haut à droite
de l’écran.
Mise en place des Puces
Puce PAGE
Côté cathode
Côté anode
5. Retirer la bande adhésive blanche côté
anode de la Puce.
6. Retirer la cache en plastique côté cathode
de la Puce.
7. Rincer délicatement les puits de tampon
d’anode et de cathode avec de l’eau
distillée. À l’aide d’une lingette en papier,
essuyer avec précaution tout liquide
présent sur la face supérieure de la Puce,
en veillant à ne pas endommager la fine
bande de gel située côté cathode.
Insertion des Puces dans le plateau
Sur l’écran tactile de l’appareil Auto2D
®
,
sélectionner OPEN (Ouvrir) > OK. Une fois le
plateau ouvert, placer la Puce PAGE (ligne bleu
clair) en orientant le côté anode vers l’avant.
Placer la Puce Solutions Plus (lignes bleu foncé)
au-dessus de la Puce PAGE en orientant les
angles coupés vers l’avant.
