B59380–AD
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9. Resuspender el botón celular en 3 mL de PBS.
10. Centrifugar 5 minutos a 150 x g y a temperatura ambiente.
11. Eliminar el sobrenadante por aspiración y resuspender el botón celular en:
•
0,5 mL o 1 mL de PBS más el 0,1 % de formaldehído si las preparaciones deben conservarse menos de 24
horas. (Se puede obtener un 0,1 % de PBS de formaldehído diluyendo 12,5 µL de solución fijadora IOTest 3
[REF A07800] a su concentración de 10x en 1 mL de PBS).
•
0,5 mL o 1 mL de PBS sin formaldehído si las preparaciones se analizan antes de 2 horas.
Advertencia: De todos modos, las preparaciones deben conservarse entre 2 y 8 °C en un lugar protegido de
la luz.
B – Procedimiento con fijación concomitante
Preparación del reactivo
Preparar extemporáneamente la mezcla “Fix-and-Lyse“ añadiendo 25 µL de Solución de Fijación IOTest 3 10X*
NO DILUIDA (Ref. A07800) a 1 mL de VersaLyse.
Mezclar en el Vórtex de 3 a 5 segundos.
(*) Advertencia: cuando se trata de la mezcla “Fix-and-Lyse“, la Solución de Fijación IOTest 3 (Ref. A07800) se
utiliza como una solución cuarenta veces concentrada y no como una solución 10X (concentración nominal).
Preparar un volumen suficiente de mezcla “Fix-and-Lyse“ en función del número de muestras que deben lisarse,
a razón de 1 mL de esta mezcla por tubo.
Para cada muestra analizada además del tubo problema, se debe incluir un tubo control en el que se incubarán
las células con el control isotípico correspondiente al marcaje específico seleccionado.
1. En cada tubo problema, introducir la cantidad de anticuerpos recomendada por el fabricante para marcar 5
x 10
5
leucocitos.
2. En cada tubo control, introducir la cantidad de control isotípico recomendada por el fabricante para marcar 5
x 10
5
leucocitos.
3. Añadir 100 µL de la muestra (prediluida o no) en los 2 tubos. Mezclar suavemente en el Vórtex.
4. Incubar según las condiciones estipuladas en la ficha técnica de los anticuerpos utilizados.
5. Añadir 1 mL de mezcla “Fix-and-Lyse“ y mezclar inmediatamente en el Vórtex 1 segundo.
6. Incubar al menos 10 minutos a temperatura ambiente (18 – 25 °C) y en un lugar protegido de la luz.
En caso de un procedimiento sin lavado, los tubos están listos para el análisis en el citómetro.
Advertencia: Si se han de lavar las preparaciones, no analizarlas antes de haber realizado las siguientes
etapas (7 a 11).
7. Centrifugar 5 minutos a 150 x g y a temperatura ambiente.
8. Eliminar el sobrenadante por aspiración.
9. Resuspender el botón celular en 3 mL de PBS.
10. Centrifugar 5 minutos a 150 x g y a temperatura ambiente.
11. Elimine el líquido que flota en la superficie mediante aspiración y vuelva a suspender el sedimento celular en
0,5 mL o 1 mL de PBS más el 0,1 % de formaldehído si las preparaciones deben conservarse menos de 24
horas. (Se puede obtener un 0,1 % de PBS de formaldehído diluyendo 12,5 µL de solución fijadora IOTest 3
[REF A07800] a su concentración de 10x en 1 mL de PBS).
Se pueden conservar estas preparaciones 24 horas entre 2 y 8 °C en un lugar protegido de la luz.
ANTICOAGULANTE
La sal tripotásica de EDTA (K3EDTA) proporciona los mejores resultados, cualquiera que sea la metodología
empleada, con o sin lavado después de la lisis.
El ACD y la heparina dan buenos resultados con todos los procedimientos, excepto el procedimiento sin fijación
concomitante cuando va seguido de un lavado. Con estos anticoagulantes, se recomienda el procedimiento con
fijación concomitante, seguido de un lavado.
