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compte tenu de leurs caractéristiques de diffusion de la lumière, ils sortent des régions de conditionnement
et conduisent à des résultats erronés
(6)
. Une agitation rigoureuse au vortex permet de les dissocier.
8. Eliminer le surnageant par aspiration.
9. Resuspendre le culot cellulaire dans 3 mL de PBS.
10. Centrifuger à 150 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
11. Eliminer le surnageant par aspiration et resuspendre le culot cellulaire dans :
•
0,5 mL ou 1 mL de PBS plus 0,1 % de formaldéhyde si les préparations doivent être conservées moins de
24 heures. (Un PBS avec 0,1 % de formaldéhyde peut être obtenu en diluant 12,5 µL de la solution de fixation
IOTest 3 (REF A07800) car c’est sa concentration 10x dans 1 mL de PBS).
•
0,5 mL ou 1 mL de PBS sans formaldéhyde, si les préparations sont destinées à être analysées dans les 2
heures.
Nota Bene : Dans tous les cas, conserver les préparations entre 2 et 8 °C et à l'abri de la lumière.
B – Procédure avec fixation concomitante
Préparation du réactif
Préparer extemporanément le mélange “Fix-and-Lyse“ en ajoutant 25 µL de Solution de Fixation IOTest 3 10X*
NON DILUEE (Réf. A07800) à 1 mL de VersaLyse.
Vortexer de 3 à 5 secondes.
(*) Nota Bene : dans le cadre du mélange “Fix-and-Lyse“, la Solution de Fixation IOTest 3 (Réf. A07800) est utilisée
comme une solution quarante fois concentrée et non pas comme une solution 10X (concentration nominale).
Préparer un volume suffisant de mélange “Fix-and-Lyse“ en fonction du nombre d’échantillons à lyser, à raison de
1 mL de ce mélange par tube.
Pour chaque échantillon analysé, prévoir en plus du tube test, un tube contrôle dans lequel les cellules seront
mises en présence du contrôle isotypique correspondant au marquage spécifique choisi.
1. Dans chaque tube test, introduire la quantité d’anticorps recommandée par le fabricant pour marquer 5 x 10
5
leucocytes.
2. Dans chaque tube contrôle, introduire la quantité de contrôle isotypique recommandée par le fabricant pour
marquer 5 x 10
5
leucocytes.
3. Ajouter 100 µL de l’échantillon à tester (prédilué ou non) dans les 2 tubes. Vortexer doucement.
4. Incuber selon les conditions stipulées dans la fiche technique des anticorps utilisés.
5. Ajouter 1 mL de mélange “Fix-and-Lyse“ et vortexer immédiatement 1 seconde.
6. Incuber au minimum 10 minutes à température ambiante (18 – 25 °C) et à l'abri de la lumière.
Dans le cas d’une procédure sans lavage, les tubes sont prêts pour l’analyse au cytomètre.
Nota Bene : Si les préparations doivent être lavées, ne pas analyser avant d’avoir réalisé les étapes 7 à 11
suivantes.
7. Centrifuger à 150 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
8. Eliminer le surnageant par aspiration.
9. Resuspendre le culot cellulaire dans 3 mL de PBS.
10. Centrifuger à 150 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
11. Éliminer le surnageant par aspiration et remettre le culot cellulaire en suspension dans 0,5 mL ou 1 mL de
PBS avec 0,1 % de formaldéhyde, si les préparations doivent être conservées moins de 24 heures. (Un PBS
avec 0,1 % de formaldéhyde peut être obtenu en diluant 12,5 µL de la solution de fixation IOTest 3 (REF
A07800) car c’est sa concentration 10x dans 1 mL de PBS).
Entre 2 et 8 °C et à l'abri de la lumière ces préparations peuvent être conservées 24 heures.
ANTICOAGULANT
Le sel tripotassique d’ EDTA (K3EDTA) donne, quelle que soit la méthodologie employée, avec ou sans lavage
après la lyse, les meilleurs résultats.
