B59380–AD
109 of 135
При процедура без промиване, епруветките са готови за флоуцитометричен анализ
NB: Ако препаратите се нуждаят от промиване, не ги анализирайте преди да извършите стъпка от 7 до
11.
7. Центрофугирайте за 5 минути при 150 xg при стайна температура.
ВАЖНО: За отбелязване е, че когато се използва процедура без едновременно фиксиране с една
промиваща стъпка, клетъчни дуплети, познати като „бегалци”, може да се формират и това да доведе
до погрешни резултати дължащи се на промяна в разпръскването на светлината и до факта, че те
избягват от полето на гейтиране
(6)
. Силно разбъркване може да провали тези дуплети.
8. Премахнете надутаечната течност чрез аспирация.
9. Ресуспендирайте Клетъчната утайка в 3 mL от PBS.
10. Центрофугирайте за 5 минути при 150 xg при стайна температура.
11. Премахнете супернатантът чрез аспирация и ресуспендирайте клетъчната утайка в:
•
0,5 mL или 1 mL PBS плюс 0,1 % формалдехид, ако препаратите трябва да бъдат съхранявани
по-малко от 24 часа. (PBS с 0,1 % формалдехид може да се получи чрез разреждане на 12,5 µL IOTest
3 фиксиращ разтвор (REF A07800) с концентрация 10X в 1 mL PBS).
•
0,5 mL или 1 mL от PBS без формалдехид, ако препаратите се анализират в рамките на 2 часа.
ЗАБЕЛЕЖКА: Във всички случай пазете препаратите между 2 и 8°C далеч от светлина.
B– Процедура с едновременно фиксиране
Подготовка на реактива.
Непосредствено преди употреба подгответе смес “Fix-and-Lyse” чрез добавяне на 25 µL от НЕРАЗРЕДЕН
IOTest 3 10X* Fixative Solution (кАТ. A07800) to 1mL от VersaLyse.
Смесете епруветките за 3 до 5 секунди.
(*) NB: в контекстът на сместа “Fix-and-Lyse“
IOTest 3 Fixative solution Кат.A07800) се използва при четиридесет пъти концентриран разтвор и не като 10X
разтвор (номинална концентрация). Подгответе достатъчен обем от “Fix-andLyse” в зависимост от броя на
пробите за лизиране (1 mL от сместа за епруветка).
За всяка анализирана проба се изисква една контрола, в която клетките са смесени с отрицателна контрола,
съответстваща на избраното специфично оцветяване.
1. çКъм всяка тест епруветка добавете препоръчано от производителя съдържание на антитела за
оцветяване на 5 x 10
5
левкоцити.
2. Към всяка контролна епруветка добавете препоръчано от производителя съдържание от изотипна
контрола за оцветяване на 5 x 10
5
левкоцити.
3. Добавете 100 µL от пробата(предварително разредена или по друг начин) към двете епруветки.
Смесете съдържанието в епруветките леко
4. Инкубирайте, като следвате посочените в техническата брошура условия за използване на антитела.
5. Добавете 1 mL от сместа “Fix-and-Lyse“ и смесете незабавно за 1 секунда..
6. Инкубирайте поне за 10 минути при стайна температура (18 -25°C), предпазени от светлина.
При процедура без промиване, епруветките са готови за флоуцитометричен анализ
NB: Ако препаратите се нуждаят от промиване, не ги анализирайте преди да извършите стъпка от 7 до
11.
7. Центрофугирайте за 5 минути при 150 xg при стайна температура.
8. Премахнете надутаечната течност чрез аспирация.
9. Ресуспендирайте Клетъчната утайка в 3 mL от PBS.
10. Центрофугирайте за 5 минути при 150 xg при стайна температура.
11. Отстранете надстоящата течност чрез аспирация и ресуспендирайте клетъчната утайка с 0,5 mL или
1 mL PBS плюс 0,1 % формалдехид, ако препаратите трябва да бъдат съхранявани по-малко от 24
часа. (PBS с 0,1 % формалдехид може да се получи чрез разреждане на 12,5 µL IOTest 3 фиксиращ
разтвор (REF A07800) с концентрация 10X в 1 mL PBS).
