B59380–AD
120 of 135
•
0,5 ml ili 1 ml PBS-a plus 0,1% formaldehida, ako će se preparati čuvati kraće od 24 sata. (PBS sa 0,1%
formaldehida se može dobiti razređivanjem 12,5 µl IOTest 3 fiksativnog rastvora (REF A07800) sa njegovom
10X koncentracijom u 1 ml PBS-a).
•
. 0,5 ml ili 1 ml PBS-a bez formaldehida, ako će se preparati analizirati u roku od 2 sata.
Napomena: U svim slučajevima preparate čuvajte na temperaturi između 2 i 8°C i zaštićene od svetlosti.
B – Postupak sa istovremenom fiksacijom
Priprema reagensa
Na licu mesta pripremite „Fix-and-Lyse“ smešu dodavanjem 25 µl NERAZREĐENOG IOTest 3 10X* fiksativnog
rastvora (REF.A07800) u 1 ml VersaLyse rastvora.
Pažljivo promešajte epruvete za uzorak u vrtložnoj mešalici 3 do 5 sekundi.
(*) Napomena: U kontekstu „Fix-and-Lyse“ smeše, IOTest 3 fiksativni rastvor (REF.A07800) se koristi kao
četrdesetostruko koncentrovani rastvor a ne kao 10X rastvor (nominalna koncentracija).
Pripremite dovoljnu zapreminu „Fix-and-Lyse“ smeše u zavisnosti od broja uzoraka koje treba lizirati (1 ml smeše
po epruveti za uzorak).
Za svaki analiziran uzorak je pored epruvete za testiranje potrebna i jedna kontrolna epruveta za uzorak u kojoj se
ćelije mešaju sa izotipskom kontrolom koja odgovara odabranom specifičnom bojenju.
1. U svaku testnu epruvetu za uzorak dodajte količinu antitela koju preporučuje proizvođač da biste obojili 5 x
10
5
leukocita.
2. U svaku kontrolnu epruvetu za uzorak dodajte količinu izotipske kontrole koju preporučuje proizvođač da biste
obojili 5 x 10
5
leukocita.
3. Dodajte 100 µl uzorka (prethodno razređenog ili drugog) u obe epruvete za uzorak. Pažljivo izmešajte
epruvete za uzorak u vrtložnoj mešalici.
4. Inkubirajte u skladu sa uslovima navedenim u tehničkom uputstvu za korišćena antitela.
5. Dodajte 1 ml „Fix-and-Lyse“ smeše i odmah izmešajte u vrtložnoj mešalici 1 sekundu.
6. Inkubirajte najmanje 10 minuta na sobnoj temperaturi (18–25°C), zaštićeno od svetlosti.
U slučaju postupka bez pranja, epruvete za uzorak su spremne za citometrijsku analizu.
Napomena: Ako preparate treba isprati, nemojte vršiti analizu pre izvršavanja koraka 7 do 11.
7. Centrifugirajte 5 minuta na 150 x g, na sobnoj temperaturi.
8. Usisajte supernatant.
9. Ponovo suspendujte talog ćelija u 3 ml PBS-a.
10. Centrifugirajte 5 minuta na 150 x g, na sobnoj temperaturi.
11. Uklonite supernatant aspiracijom i ponovo suspendujte talog ćelija u 0,5 ml ili 1 ml PBS-a plus 0,1%
formaldehida, ako će se preparati čuvati kraće od 24 sata. (PBS sa 0,1% formaldehida se može dobiti
razređivanjem 12,5 µl IOTest 3 fiksativnog rastvora (REF A07800) sa njegovom 10X koncentracijom u 1 ml
PBS-a).
Ovi preparati se mogu čuvati 24 sata na temperaturi između 2 i 8°C, zaštićeno od svetlosti.
ANTIKOAGULANS
Trikalijumska so EDTA (K3EDTA) daje najbolje rezultate, nezavisno od korišćene metodologije, sa ili bez pranja
nakon liziranja.
ACD i heparin daju dobre rezultate u svim postupcima osim postupka bez istovremene fiksacije nakon koje sledi
pranje. Sa ovim antikoagulansima preporučujemo postupak sa istovremenom fiksacijom, nakon koje sledi pranje.
ANALIZA
Ostaci eritrocita mogu dovesti do porasta signala difrakcije uskougaone svetlosti (prednje rasejanje ili FS) većeg
od onog dobijenog sa drugim komercijalnim reagensima za liziranje. Kao rezultat toga, uobičajeno podešavanje
(ili fiksno podrazumevano) diskriminatora („praga“) na ovom parametru može biti suviše slabo za VersaLyse.
Zato je preporučljivo da se citometar podesi na početku prikupljanja podataka o tipičnom preparatu. Na primer, u
slučaju pune lizirane krvi, preporučljivo je da se prvo postepeno povećava vrednost diskriminatora dok su populacije
leukocita vidljive na histogramu tipa FS u odnosu na SS; zatim da se pažljivo podesi pojačanje FS i SS signala
kako bi se dobila distribucija populacije leukocita koja je identična onoj na slikama 1 i 2.
