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Osservando tramite gli oculari e muovendo il tavolino con la manopola di messa a fuoco grossolana (fig. 2, 13), ottenere l’immagine
della superficie del foglio di carta. Spostando il foglio di carta sul tavolino, portare l’immagine del segno "+" al centro del campo
visivo dell’oculare. Ruotare il revolver portaobiettivi fino a posizionare lo slot vuoto nel cammino ottico.
Osservando di lato (e non dagli oculari) la superficie del foglio di carta, muovere il collettore con la manopola (fig. 1, 7) per
ottenere la proiezione più nitida possibile dell’arco voltaico e degli elettrodi della lampada a vapori di mercurio. Usando le
manopole 10 e 11 (fig. 1), che regolano la posizione della lampada a vapori di mercurio, posizionare l’immagine dell’arco
voltaico sopra al segno "+" sul foglio (nel centro del campo visivo dell’oculare). Inserire l’obiettivo con ingrandimento 4x e poi
l’obiettivo a 10x nel cammino ottico. Osservando tramite gli oculari e muovendo il collettore con la manopola (fig. 1, 7), ottenere
l’illuminazione più uniforme possibile sul campo visivo.
Osservazione dei campioni
Per le osservazioni in fluorescenza, i campioni sono preparati con coloranti speciali (fluorofori) dotati di specifiche caratteristiche
spettrali di assorbimento (eccitazione) ed emissione. Secondo il fluoroforo usato per la preparazione del vetrino, sarà necessario
selezionare uno dei cinque beam splitter da inserire lungo il cammino ottico dell’illuminatore di fluorescenza, come indicato nella
tabella 1 nella sottosezione "Sistema di illuminazione in luce incidente".
Ad esempio, per un vetrino preparato con un marcatore comune come il FITC è necessario usare l’unità n.3 ("B"), per l’auramina va
usata l’unità n.4 ("V"), per dei coloranti con emissione nella regione del rosso, si usa l’unità n.2 ("G"). Per i coloranti DAPI o Hoechst, si
usa l’unità n.6 ("U"); quando si lavora con questa unità, il filtro deve essere rimosso dal cammino ottico tramite la manopola (fig. 2, 1).
Quindi, procedere come segue:
•
posizionare l’oggetto sul tavolino (fig. 2, 10) del microscopio;
•
allineare la lente obiettivo con ingrandimento 10x con il cammino ottico del fascio luminoso (si consiglia di iniziare
il processo di messa a fuoco da un obiettivo con ingrandimento medio o basso e con distanza di lavoro e campo
sufficientemente larghi);
•
mettere a fuoco il microscopio ruotando le manopole (fig. 2, 12 e 13) per ottenere un’immagine nitida dell’oggetto;
•
chiudere i diaframmi di campo e di apertura con le manopole (fig. 1, 5 e 6);
•
osservando l’immagine dell’oggetto, assicurarsi che l’immagine dell’iride del diaframma di campo sia concentrica al campo
dell’oculare (in caso il diaframma sia mal posizionato, procedere all’allineamento);
•
se l’immagine del diagramma di campo non è centrata, posizionarla al centro del campo visivo usando le manopole (fig. 2, 2);
•
aprire il diaframma di campo con la manopola (fig. 1, 5) confrontandolo con il diametro del campo visto dall’oculare, in
modo che il bordo del diaframma a iride sia appena al di fuori del campo dell’oculare;
•
aprire il diaframma di apertura con la manopola (fig. 1, 6), osservando il campo visivo dell’oculare, assicurarsi che
l’illuminazione sia uniforme e, se necessario, regolare il fuoco del collettore con la manopola (fig. 1, 7);
•
eseguire la messa a fuoco dell’oggetto in esame tramite l’osservazione binoculare, così come descritto nella sottosezione
"Messa a fuoco del microscopio per l’osservazione binoculare" per le applicazioni in luce trasmessa;
•
iniziare l’esame dell’oggetto con brevi pause durante l’osservazione. Per minimizzare il decadimento del fluoroforo, è
necessario interrompere il fascio luminoso della lampada con l’apposita manopola (fig. 2, 1).
Ingrandimento del microscopio e diametro del campo sull’oggetto
L’ingrandimento totale del microscopio Г durante l’osservazione con una testata binoculare si determina usando la seguente
formula:
Γ
=
β
ob ∙
β
h ∙
Γ
eye
in cui βob è l’ingrandimento lineare dell’obiettivo del microscopio;
βh è l’ingrandimento lineare della testata, pari a 1,0;
Гeye è l’ingrandimento visibile dell’oculare.
Il diametro del campo osservato sull’oggetto, Dob in mm, di determina usando la seguente formula:
D
ob =
D
eye
β
ob ∙
β
h
in cui Deye è il diametro del campo dell’oculare, limitato dal diaframma di campo dell’oculare, in mm.
