37
•
zkontrolujte nastavení osvětlení mikroskopu (aperturní clona kondenzoru musí být otevřená o velikost oka čočky nebo o 2/3
velikosti oka).
Pozorování objektů ve fluorescenčním světle
Aktivace rtuťové výbojky a nastavení osvětlení
Připojte napájecí zdroj rtuťové výbojky do elektrické sítě. Zapněte rtuťovou výbojku přepnutím vypínače napájení do polohy "I".
Rtuťová výbojka potřebuje nejméně 10 minut, aby dosáhla provozních parametrů. Normální režim provozu výbojky znamená, že
ručičky ampérmetru a voltmetru jsou uprostřed stupnice.
VAROVÁNÍ! RTUŤOVOU VÝBOJKU NEVYPÍNEJTE DŘÍVE, NEŽ 15 MINUT PO ZAŽEHNUTÍ! VÝBOJKU JE MOŽNÉ ZNOVU
ZAPNOUT AŽ PO UPLYNUTÍ 15—20 MINUT PO VYPNUTÍ!
Na list bílého papíru o velikosti stolku nakreslete znaménko "+" a položte jej na stolek. Umístěte objektiv se zvětšením 4x do
dráhy paprsků. Zasuňte knoflík (obr. 2, 1) do krytu a umístěte filtr do dráhy paprsků. Pomocí knoflíků (obr. 1, 5 a 6) otevřete clonu
zorného pole a aperturní clonu. Namontujte prstenec (obr. 1, 27) pro přepínání dělicích jednotek spektrálního paprsku do polohy
No.3 ("B").
Dívejte se do okuláru a pohybujte stolkem pomocí makrošroubu pro hrubé zaostření (obr. 2, 13), abyste získali obraz povrchu
listu papíru. Pohybujte listem papíru po povrchu stolku, aby se obraz znaménka "+" dostal do středu pole okuláru. Umístěte sedlo
revolverového nosiče bez objektivu do dráhy paprsků.
Pozorujte povrch listu papíru ze strany (nikoli z okuláru) a posuňte kolektor pomocí knoflíku (obr. 1, 7), abyste získali nejostřejší
obraz obloukového výboje a elektrod rtuťové výbojky. Pomocí knoflíků 10 a 11 (obr. 1), kterými se reguluje polohu rtuťové výbojky,
umístěte obraz obloukového výboje na značku "+" na povrchu listu papíru (ve středu pole okuláru). Umístěte objektiv se zvětšením
4x a pak 10x do dráhy paprsků. Dívejte se do okuláru a pohybujte kolektorem pomocí knoflíku (obr. 1, 7), abyste získali co
nejrovnoměrnější osvětlení pole.
Pozorování objektů
Pro zkoumání ve fluorescenčním světle jsou objekty vystaveny působení speciálních barviv (fluorochromů) se specifickými
spektrálními charakteristikami absorpce (excitace) a záře. V souladu s fluorochromem použitým k ošetření preparátu je nutné
nainstalovat do dráhy paprsků fluorescenčního osvětlovacího tělesa jednu z pěti dělicích jednotek paprsku uvedených v tabulce 1
podkapitoly "Systém osvětlení dopadajícím světlem".
Například pro poměrně běžné ošetření preparátů pomocí FITC je vyžadována spektrální jednotka No.3 ("B"), pro auramin —
jednotka No.4 ("V"), pro skvrny zářící v červeném spektrálním rozsahu — jednotka No.2 ("G"). U skvrn DAPI a Hoechst se používá
jednotka No.6 ("U"); při práci s touto jednotkou musí být pomocí knoflíku (obr. 2, 1) odstraněn filtr z dráhy paprsků.
Dále proveďte následující:
•
umístěte objekt na stolek (obr. 2, 10) mikroskopu;
•
zaveďte objektiv se zvětšením 10x do dráhy paprsků (doporučuje se zahájit proces zaostřování objektivy s malým nebo
středním zvětšením s dostatečně velkými poli a operačními vzdálenostmi);
•
zaostřete mikroskop otáčením knoflíků (obr. 2, 12 a 13), abyste získali ostrý obraz objektu;
•
pokryjte clonu zorného pole a aperturní clonu pomocí knoflíků (obr. 1, 5 a 6);
•
pozorujte obraz objektu a ujistěte se, zda je obraz pole irisové clony umístěn soustředně s polem okuláru (pokud je clona
posunuta, zarovnejte ji);
•
pokud je obraz clony zorného pole posunut, umístěte jej do středu pole pomocí knoflíků (obr. 2, 2);
•
otevřete clonu zorného pole knoflíkem (obr. 1, 5) spolu s průměrem pole okuláru, takže okraje irisové clony budou nepatrně
za polem okuláru;
•
otevřete aperturní clony pomocí knoflíku (obr. 1, 6), sledujte pole okuláru a ujistěte se, že je osvětlení rovnoměrné. V
případě potřeby upravte zaostření kolektoru pomocí knoflíku (obr. 1, 7);
•
proveďte zaostření na objekt pro pozorování pomocí binokulárních tubusů stejným způsobem, jaký je uveden v podkapitole
"Zaostření mikroskopu pro binokulární pozorování" při práci v procházejícím světle;
•
začněte zkoumat objekty s krátkými přestávkami v práci. Aby se zabránilo vyblednutí preparátu, je nutné zachytit světelný
tok z výbojky pomocí knoflíku (obr. 2, 1).
Zvětšení mikroskopu a průměr pole na objektu
Celkové zvětšení mikroskopu Г v procesu vizuálního pozorování pomocí binokulární hlavice se stanoví pomocí následujícího
vzorce:
Γ
=
β
ob ∙
β
h ∙
Γ
eye
kde βob — lineární zvětšení objektivu mikroskopu;
βh — lineární zvětšení hlavice rovné 1,0;
Гeye — viditelné zvětšení okuláru.
Průměr pole pozorovaný na objektu, Dob mm, se určí pomocí následujícího vzorce:
D
ob =
D
eye
β
ob ∙
β
h
kde Deye — průměr pole okuláru omezený clonou zorného pole okuláru v mm.
